il1受体拮抗剂对大鼠肝星状细胞ⅰ、ⅲ型胶原及timp1mrna表达的影响

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1、IL1受体拮抗剂对大鼠肝星状细胞Ⅰ、Ⅲ型胶原及TIMP1mRNA表达的影响：邓存良,黄捷,陈文,王明勇,陈枫【摘要】　　目的:研究白细胞介素1受体拮抗剂（IL1ra）对大鼠肝星状细胞（HSC）Ⅰ型胶原（ColⅠ）、Ⅲ型胶原（ColⅢ）和基质金属蛋白酶组织抑制因子1（TIMP1）基因表达的影响,探讨IL1ra抗肝纤维化作用的机制。方法:原位分离、培养大鼠HSC,荧光显微镜观察及免疫细胞化学染色法鉴定。用1μg/L、10μg/L、100μg/L3个浓度的IL1ra分别作用于HSC48h,实时荧光定量RTPCR法检测ColⅠ、

2、ColⅢ和TIMP1mRNA的表达。结果:对照组ColⅠ、ColⅢ和TIMP1mRNA的表达水平分别为1.97±0.29、2.70±0.57、3.83±0.30。加入1μg/L、10μg/L、100μg/LIL1ra后ColⅠ基因表达水平依次为1.34±0.35、0.86±0.19、0.35±0.03;ColⅢ基因表达水平依次为2.02±0.29、1.13±0.09、0.47±0.11;TIMP1mRNA的表达水平依次为3.12±0.25、2.53±0.38、1.98±0.18,与对照组比较,不同浓度处理组ColⅠ、Col

3、Ⅲ和TIMP1mRNA的表达均明显降低（P<0.05）。结论:IL1ra以剂量依赖方式抑制HSC中ColⅠ、ColⅢ及TIMP1mRNA的表达,具有抗纤维化作用。【关键词】肝星状细胞白细胞介素1受体拮抗剂Ⅰ型胶原Ⅲ型胶原基质金属蛋白酶组织抑制因子1　　肝纤维化是所有慢性肝病共有的病理改变。IL1是纤维化形成过程中重要的细胞因子。可以活化肝星状细胞（hepaticstellarcell,HSC）,进而促进其分泌Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型胶原、层黏连蛋白等多种细胞外基质成分及基质金属蛋白酶组织抑制因子(tissueinhibitorofme

4、talloproteinases,TIMPs),从而促进肝纤维化的发生发展。我们的前期工作表明白细胞介素1受体拮抗剂（interleukinⅠreceptorantagonist,IL1ra）可抑制肝纤维化大鼠星状细胞的增殖和胶原的合成,减少肝脏细胞外基质的沉积［1］。有研究发现IL1β受体拮抗剂可降低TIMP1mRNA的表达［2］。本试验的目的是系统观察IL1ra对HSC表达Ⅰ型胶原（CollagenⅠ,ColⅠ）、Ⅲ型胶原（CollagenⅢ,ColⅢ）和TIMP1基因的影响,探讨IL1ra抗肝纤维化作用的机制。　　1材料

5、和方法　　1.1材料I1640培养液,反复吹打,使细胞充分混匀。50g离心2min（20℃）,反复2次,弃沉淀。上清液500g离心7min（20℃）,弃上清,沉淀用RPMI1640培养液500g离心冲洗2次。加入RPMI1640液12mL、330g/LNycodenz液各6mL,充分混匀,将细胞悬液分装入10mL离心管。在细胞悬液上小心滴加一层RPMI1640培养液,1500g离心15min（20℃）。将RPMI1640液与细胞悬液交界面间的细胞吸出,用RPMI1640液500g离心7min（20℃）,冲洗2次。然后将细胞悬浮于含200mL/

6、L胎牛血清RPMI1640培养液中,移至细胞培养瓶,置37℃50mL/LCO2培养。2～3d传代1次。用荧光显微镜观察新鲜分离的HSC,HSC在波长为328nm荧光显微镜下有蓝绿色自发荧光。用免疫细胞化学染色法（SABC法）鉴定分离细胞的Desmin表达:将盖玻片放入装有细胞悬液的培养皿中,待细胞贴壁伸展后,取出盖玻片,自然干燥;30mL/LH2O2去离子水孵育5～10min,双蒸水冲洗,PBS浸泡5min;滴加一抗（鼠抗人desminmAb,稀释度1∶100）,阴性对照以0.01mol/LPBS代替一抗,湿盒37℃恒温孵育2h;PBS液清洗

7、2min×3次,滴加生物素化二抗,湿盒37℃恒温孵育20min;PBS清洗5min×3次,DAB显色,室温镜下控制反应时间,双蒸水终止反应。苏木素液轻度复染,二甲苯透明,中性树胶封片。显微镜下照相。　　1.2.2实验分组及处理HSC细胞1×106接种于100mL/L胎牛血清的培养皿中,常规培养24h后换含终浓度为用1μg/L、10μg/L、100μg/L3个浓度的IL1ra的无血清RPMI1640培养液,6h后加入胎牛血清使成为100mL/L胎牛血清,RPMI1640培养液继续培养,作用48h。对照组为不含ILra的培养液。每组4孔细胞。

8、　　1.2.3Ⅰ、Ⅲ胶原、TIMP1mRNA表达的检测按试剂盒说明书提取细胞的总RNA。取逆转录产物cDNA模板3μL,分别加入含有荧光染料50μL的反应体系中,