il1受体拮抗剂对大鼠肝星状细胞ⅰ、 ⅲ型胶原及timp1 mrna表达的影响

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1、IL1受体拮抗剂对大鼠肝星状细胞Ⅰ、Ⅲ型胶原及TIMP1mRNA表达的影响作者：邓存良,黄捷,陈文,王明勇,陈枫【摘要】　　目的:研究白细胞介素1受体拮抗剂（IL1ra）对大鼠肝星状细胞（HSC）Ⅰ型胶原（ColⅠ）、Ⅲ型胶原（ColⅢ）和基质金属蛋白酶组织抑制因子1（TIMP1）基因表达的影响,探讨IL1ra抗肝纤维化作用的机制。方法:原位分离、培养大鼠HSC,荧光显微镜观察及免疫细胞化学染色法鉴定。用1μg/L、10μg/L、100μg/L3个浓度的IL1ra分别作用于HSC48

2、h,实时荧光定量RTPCR法检测ColⅠ、ColⅢ和TIMP1mRNA的表达。结果:对照组ColⅠ、ColⅢ和TIMP1mRNA的表达水平分别为1.97±0.29、2.70±0.57、3.83±0.30。加入1μg/L、10μg/L、100μg/LIL1ra后ColⅠ基因表达水平依次为1.34±0.35、0.86±0.19、0.35±0.03;ColⅢ基因表达水平依次为2.02±0.29、1.13±0.09、0.47±0.11;TIMP1mRNA的表达水平依次为3.12±0.25

3、、2.53±0.38、1.98±0.18,与对照组比较,不同浓度处理组ColⅠ、ColⅢ和TIMP1mRNA的表达均明显降低（P<0.05）。结论:IL1ra以剂量依赖方式抑制HSC中ColⅠ、ColⅢ及TIMP1mRNA的表达,具有抗纤维化作用。【关键词】肝星状细胞白细胞介素1受体拮抗剂Ⅰ型胶原Ⅲ9型胶原基质金属蛋白酶组织抑制因子1　　肝纤维化是所有慢性肝病共有的病理改变。IL1是纤维化形成过程中重要的细胞因子。可以活化肝星状细胞（hepaticstellarcell,HSC）

4、,进而促进其分泌Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型胶原、层黏连蛋白等多种细胞外基质成分及基质金属蛋白酶组织抑制因子(tissueinhibitorofmetalloproteinases,TIMPs),从而促进肝纤维化的发生发展。我们的前期工作表明白细胞介素1受体拮抗剂（interleukinⅠreceptorantagonist,IL1ra）可抑制肝纤维化大鼠星状细胞的增殖和胶原的合成,减少肝脏细胞外基质的沉积［1］。有研究发现IL1β受体拮抗剂可降低TIMP1mRNA的表达［2］。本试验的目的是系统观察IL1r

5、a对HSC表达Ⅰ型胶原（CollagenⅠ,ColⅠ）、Ⅲ型胶原（CollagenⅢ,ColⅢ）和TIMP1基因的影响,探讨IL1ra抗肝纤维化作用的机制。　　1材料和方法　　1.1材料Wistar雄性大鼠(质量450～500g),购自第三军医大学西南医院实验动物科。IL1ra由北京大学医学部马大龙教授惠赠;鼠抗人结蛋白（desmin）单克隆抗体（mAb）购自DAKO公司;实时荧光检测试剂盒购自美国BioRad公司;PCR引物由上海生物工程公司合成部合成;总RNA提取试剂盒购自上海华舜生物

6、工程有限公司;9RTPCR试剂盒购自TaKaRa（日本）公司;RealtimePCR仪、Doc2000型凝胶成像系统购自美国BioRad公司。　　1.2方法　　1.2.1大鼠HSC的分离、培养及鉴定参照翁山耕等［3］的方法。Wistar大鼠禁食禁水12h,20g/L戊巴比妥钠腹腔麻醉,切开腹腔,用留置针头穿刺门静脉。37℃预灌注液以10mL/min的速率灌注约10min,当整个肝脏变成黄色时,换用37℃含Ⅳ型胶原酶溶液灌注至整个肝脏几乎呈液状。将肝脏从大鼠腹腔中切除,去除肝包膜及结缔组织,剪碎肝

7、组织,倒入一预装有50mL振荡消化液烧瓶,再加入含0.6g/LCaCl2的DHank’s液至100mL,37℃振荡消化30min,所得细胞悬液依次经150目、200目金属网过滤,滤液收集于离心管。500g离心7min,弃上清。每管加入40mLRPMI1640培养液,反复吹打,使细胞充分混匀。50g离心2min（20℃）,反复2次,弃沉淀。上清液500g离心7min（20℃）,弃上清,沉淀用RPMI1640培养液500g离心冲洗2次。加入RPMI1640液12mL、330g/LNycodenz液各6m

8、L,充分混匀,将细胞悬液分装入10mL离心管。在细胞悬液上小心滴加一层RPMI1640培养液,1500g离心15min（20℃）。将RPMI1640液与细胞悬液交界面间的细胞吸出,用RPMI1640液500g离心7min（20℃）,冲洗2次。然后将细胞悬浮于含200mL/L胎牛血清RPMI1640培养液中,移至细胞培养瓶,置37℃50mL/LCO2培养。2～39d传代1次。用荧光显微镜观察新鲜分离的HSC,HSC在波长为328nm荧光显微镜下有蓝绿色自发