血管紧张素ii和血管内皮生长因子在视网膜新生血管中的表达及意义

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1、血管紧张素II和血管内皮生长因子在视网膜新生血管中的表达及意义【摘要】目的：探讨血管紧张素II(angiotensinII,AngII)和血管内皮生长因子(vascularendothelialgroentofretinalneovascularization.METHODS:Itcontrolexperimentalstudy.FortysevendayoldC57BL/6Jmicelyincludingnormalcontrolgroupandhyperoxiamodelgroup.Hyperoxiamode

2、lgroupodelofoxygeninducedretinopathy.Fluorescentangiographytheretinaintothevitreousincrosssections.AngIIandVEGFproteinlevelsinretinaseasuredbyyersSquibb公司)、缬沙坦(瑞士Novartis公司)、BCA蛋白定量试剂盒(美国Pierce公司)、ECL发光试剂盒(美国Pierce公司)、异硫氰酸葡聚糖荧光素(美国Sigma公司)、兔抗小鼠AngII多克隆抗体(美国Si

3、gma公司)、兔抗小鼠VEGF多克隆抗体(美国Sigma公司)、羊抗小鼠IgGHRP(美国Sigma公司)。　　1.2方法动物分组和模型建立：将40只7d龄C57BL/6J清洁级新生小鼠随机分为两组：正常对照组和高氧模型组，每组20只。参照Smith等[3]的方法建立氧诱导视网膜病变模型，高氧模型组小鼠及哺乳母鼠置于密闭氧箱中，控制氧浓度为(75±2)%，5d(鼠龄12d)后回到正常空气环境中，正常对照组一直置于正常空气环境中。所有动物保持温度(21±1)°C，光照黑暗循环/12h。荧光素血管灌注视网膜铺片：两组

4、鼠龄17d的小鼠各取2只，将异硫氰酸葡聚糖荧光素(分子量：2×106)溶于1mL的40g/L多聚甲醛中，经左心室灌注(30mL/kg)，摘取眼球，于40g/L多聚甲醛中固定1h，游离视网膜，以视盘为中心呈放射状对称切开，用抗荧光衰退封片剂将视网膜封片，采用荧光显微镜(日本Olympus公司)观察视网膜血管形态的变化。突破视网膜内界膜的血管内皮细胞核计数：两组鼠龄17d的小鼠各取3只，摘除眼球后，于40g/L多聚甲醛中固定24h，常规脱水，石蜡包埋，平行于角膜至视盘的矢状位连续6μm切片，苏木素伊红染色。每只眼球取1

5、0张切片，每组30张，由同一操采用随机、盲法在光学显微镜(日本Olympus公司)下对切片样本计数每张切片突破视网膜内界膜的血管内皮细胞核数。选取切片时注意避开视盘周围，计数血管内皮细胞核时仅计数与内界膜有紧密联系的细胞核，不包括玻璃体腔内其它与内界膜无联系的血管内皮细胞核。Westernblot检测AngII及VEGF蛋白表达：两组鼠龄17d的小鼠各取15只，每组取5只新生鼠双眼完整的视网膜，提取视网膜组织蛋白质，用BCA蛋白定量试剂盒定量视网膜组织蛋白质含量，每个样品上样含量50μg，以100g/LSDSPAG

6、E电泳(4℃，120V，2h)分离蛋白质，电转移法将蛋白质转移至硝酸纤维素滤膜上，用40g/L脂奶粉，于4℃下过夜封闭硝酸纤维素滤膜的非特异性蛋白质结合位点，将滤膜于兔抗小鼠AngII多克隆抗体(1∶400)、兔抗小鼠VEGF多克隆抗体(1∶400)在37℃下孵育2h，TBST缓冲液冲洗滤膜3次后，将滤膜转移至二抗羊抗小鼠IgGHRP(1∶1000)，37℃下孵育1h，TBST缓冲液再次冲洗滤膜后，ECL化学发光显影。采用βactin(1∶400)作为内参照。每组样品重复检测3次。应用QuantityOne4

7、.2软件分析，分别比较各组AngII，VEGF条带灰度值与βactin条带灰度值的比值，表示各组蛋白相对表达水平。　　统计学分析：所有数据应用SPSS16.0forWindows进行统计学分析，结果以±s表示，计量资料组间比较采用独立样本t检验，两变量间相关性采用Pearson相关分析，以P<0.05作为差异有统计学意义。　　2结果　　2.1荧光素血管灌注视网膜铺片正常对照组自视盘发出的血管向四周呈放射状均匀分布，直至视网膜周边部，视网膜血管交叉成网状，分深浅两层，浅层血管呈放射状分支形态，深层血管呈多角形网

8、状形态，两层血管通过螺旋血管互相连接(图1A);而高氧模型组视盘周围可见大片无灌注区，视网膜血管不规则扩张，走行迂曲，无灌注区周围可见大量新生血管丛，伴明显荧光渗漏(图1B)。　　2.2突破视网膜内界膜的血管内皮细胞核数正常对照组未发现或仅在少数切片中发现突破视网膜内界膜的血管内皮细胞核(图2A);而高氧模型组可见较多突破视网膜内界膜的血管内皮