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《17β雌二醇抑制丙泊酚诱导皮质神经元凋亡的机制》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。
1、17β雌二醇抑制丙泊酚诱导皮质神经元凋亡的机制 丙泊酚作为常用的静脉全身麻醉药，通过激动GABA受体和抑制NMDA受体发挥麻醉作用，具有起效快、苏醒快、不良反应少等优点，广泛用于麻醉诱导和维持。丙泊酚是否适用于新生儿和婴幼儿的全身麻醉，目前观点不一。研究表明GABA受体在发育期大脑作为一种兴奋性神经递质，激动GABA受体引起氯离子外流使细胞膜去极化，产生兴奋性神经毒性[1].最近动物实验研究表明，反复大剂量使用丙泊酚可对发育期动物大脑产生损伤，导致发育期动物大脑广泛脑区神经细胞凋亡的显着增加，甚至
2、影响动物成年后的学习记忆功能[2,3]. 体外细胞实验研究也表明丙泊酚具有发育期神经毒性，可诱导原代培养神经元凋亡[4,5].丙泊酚发育期神经毒性引起了众多学者的广泛关注，因此研究丙泊酚发育期神经毒性的发生机制以及寻找安全有效的措施防治丙泊酚发育期神经毒性已成为麻醉医师关注的重要课题。以往研究表明17β雌二醇作为一种内源性神经甾体可对GABA受体激动剂苯巴比妥和NMDA受体抑制剂MK-801和氯胺酮产生的发育期大鼠大脑损伤产生保护作用[6-8]. 17β雌二醇是否对丙泊酚诱导
3、的原代培养皮层神经元凋亡产生保护作用以及机制尚不清楚，本实验将从凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax及cleavedcaspase-3水平变化等方面研究17β雌二醇抑制丙泊酚诱导原代培养皮质神经元凋亡的机制，以期为临床应用17β雌二醇防治丙泊酚的发育期神经毒性提供实验依据。 1材料和方法。 1.1材料。 丙泊酚（Diprivan,意大利AstraZeneca公司，批号：KEM培养液、胎牛血清、Neurobasal培养液、B27促生长剂购自美国Gibco公司，17β雌二醇
4、、DMSO购自美国Sigma公司，Hoechst33258和胰蛋白酶购自北京索来宝公司，TUNEL试剂盒购自德国Mannheim公司，Bcl-2、Bax及cleavedcaspase-3抗体购自美国CellSignalTechnology公司。 1.2方法。 1.2.1皮层神经元原代培养：取新生24h内的SD幼鼠（清洁级，体质量5~6g,雌雄不限，河北省实验动物中心提供，生产许可证号：SCXK（冀）2008-1003）大脑额叶皮层组织，用冷PBS洗剂，剪碎，移入0.125%胰蛋白酶中置于37℃水
5、浴锅内充分消化15min,用含10%胎牛血清的DMEM培养基终止消化，吸弃上清液，然后把细胞转移到含10%胎牛血清的DMEM培养基中用巴氏滴管轻轻吹打细胞制成细胞悬液。然后经100目钢丝筛过滤，计数后按1109/L的密度接种于经多聚赖氨酸处理的培养板中，放于5%CO2培养箱37℃恒温培养24h后，全量换Neurobasal+B27培养基，以后每隔2d半量换液1次。体外培养7d的神经元用于实验。 1.2.2实验分组：原代培养7d的大鼠皮层神经元，随机分为3组：溶剂对照组（给予等溶剂20%脂肪乳）,丙
6、泊酚组（丙泊酚终浓度为500μmol/L）,17β雌二醇+丙泊酚组（17β雌二醇终浓度为0.1μmol/L,17β雌二醇加入2h后，给予丙泊酚，其终浓度为500μmol/L）. 1.2.3Hoechst33258核染色法检测神经元凋亡：将神经元接种于6孔培养板中，按上述分组方法给予不同药物处理后，移去培养液，用4℃PBS冲洗3遍后，加入4%多聚甲醛固定30min,去除多聚甲醛固定液，用冷PBS液冲洗3遍，加入Hoechest33258染色8min,P
7、BS漂洗3遍，荧光显微镜下随机选取5个视野进行形态学观察和计数，计算凋亡率。凋亡率（%）=凋亡细胞数/细胞总数100%. 1.2.4应用TUNEL法检测神经元凋亡：应用TUNEL法检测神经元凋亡将细胞涂片用4%多聚甲醛室温下固定30min,然后PBS洗3次，0.3%H2O2封闭内源性过氧化酶30min,然后在0.1%TritonX-100的0.1%柠檬酸钠溶液中4℃孵育5min,将50μLTUNEL反应液在37℃湿盒中反应60min,PBS冲洗3次，然后再加入50μL可转变还氧化酶反应
8、液，37℃湿盒中孵育30min,最后加入50μL底物反应液室温反应10min.光镜下观察神经元，细胞核有棕黄色颗粒者为阳性神经元，采取5个不同的视野，计算阳性和阴性细胞数量。 1.2.5u;g加上样缓冲液煮沸变性，于10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶中100V电泳1.5h,转膜2h,加入Bcl-2,Bax及cleavedcaspase-3抗体（1:2000）,4℃过夜，常规洗涤，加羊抗鼠二抗（1:5000）,37℃孵育60min,洗涤，电化学法发光，显影，扫
