狂犬病快速诊断方法的建立和应用

《狂犬病快速诊断方法的建立和应用》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。

1、狂犬病快速诊断方法的建立和应用曹亮[1]，扈荣良*，张首纷（军事医学科学院军事兽医研究所吉林长春130062） 摘要：根据狂犬病病毒核蛋白基因序列设计了1对引物，利用RT-PCR技术从狂犬病病毒CVS株、8202株和SRV9株的含毒细胞培养物及乳鼠脑组织中，扩增出443bp的核酸片段，敏感性约为3pg。对36份不同种动物脑组织的检测结果与传统方法荧光抗体试验（FAT）和小鼠脑内接种试验（MIT）的测定结果完全吻合，但前者可在3h内直接对组织匀浆进行诊断，具有快速、简便、和敏感的特点。关键词：狂犬病病毒；RT-PCR；检测中图分类号：

2、文献标识码：文章编号：1671-7236（2005） 狂犬病是由狂犬病病毒感染中枢神经系统而引起的一种人畜共患传染病。狂犬病病毒（Rabiesvirus）为弹状病毒科（Rhaboviridae）,狂犬病毒属（Lyssaavirus）成员，其基因组为单股负链RNA，编码N、P、M、G、L等5种结构蛋白。核蛋白（N）基因高度保守又高效表达，可以用于狂犬病病毒感染的诊断和调查。本研究根据N基因的保守性设计了1对引物，对狂犬病病毒不同毒株进行了RT-PCR检测，并对不同种动物脑组织进行了RT-PCR检测，旨在为及时诊断狂犬病提供一种可靠、快

3、速、准确的监测手段。1.    材料与方法1.1材料1.1.1毒株和细胞株CVS、8202和SRV9毒株由本室保存，BHK-21细胞由本室保存。1.1.2试验样本36份脑组织（犬脑12份、鼠脑10份、牛脑8份、鹿脑4份、马脑2份）均为FAT和MIT阳性，由各地收集本室保存。1.1.3主要试剂RNA提取试剂、RT-PCR试剂均购自TaKaRa公司1.1.4主要仪器PCR仪（军事医学科学院放射研究所）、电泳仪（北京六一仪器厂）、高速台式冷冻离心机（Sigma）、CO2培养箱（SANYO）、凝胶自动成像系统（UVI）1.2病毒培养以含10

4、%犊牛血清的MEM营养液，按常规量加入双抗、谷氨酰胺和NaHCO3，待BHK21细胞长成单层后，以含2%血清MEM营养液换液，同时按2%分别接入CVS株、8202株和SRV9株狂犬病病毒，置33℃培养72—96h收获病毒[1-3]。分别将20ulCVS株、8202株和SRV9株狂犬病病毒脑内接种3日龄乳鼠，待4-5天濒死期采取鼠脑。1.3引物的设计与合成根据N基因序列[4-6]设计了1对引物N1、N2，由上海生物工程公司合成。引物序列如下：N1：（587）5’-TTTGAGACTGCTCCTTTTG-3’(605)N2：(1029)

5、5’-CCCATATAGCATCCTAC-3’(1013)1.4RNA的提取病毒细胞培养物和鼠脑组织按TRIZOL一步法[7]提取。1.5RT-PCR取10╳OneStepRNAPCRBuffer2.5µL、25mMMgCl25µL、10mMdNTP2.5µL、RnaseInhibitor、AMV和AMV-OptimizedTaq各0.5µL、引物1µL，制成混合液，加入12.5µLDEPC水溶解的RNA，混合均匀后50℃30minRT反应，然后放入PCR仪中，执行如下程序：94℃变性120s后，于94℃30s、50℃90s、72℃

6、60s，循环扩增30次，最后72℃延伸10min。琼脂糖凝胶电泳鉴定。1.6    敏感性试验将含毒的BHK-21细胞培养物中所提取RNA做10倍系列稀释后，进行RT-PCR扩增，比较其扩增的敏感性。1.7重复性试验将狂犬病病毒CVS株、8202株和SRV9株的RNA反转录产物以N1/N2分别作3次PCR扩增，经琼脂糖凝胶电泳后，分析结果。1.8应用性试验取36份不同种动物脑组织，分别为：犬12份、鼠10份、牛8份、鹿4份、马2份，均为FAT和MIT检测阳性。提取RNA，使用引物N1/N2进行RT-PCR检测。2          

7、结果2.1RT-PCR扩增用设计的引物对狂犬病病毒CVS株、8202株和SRV9株核酸进行RT-PCR扩增，结果均得到443bp的核酸片段，与设计相符，说明其为特异性扩增产物。在相同的反应条件下，对照样品犬腺病毒和犬瘟热病毒及正常细胞培养物和鼠脑组织扩增结果为阴性。（图1略）2.2敏感性试验以N1/N2引物对所提RNA(3.25µg)10-1—10-7稀释后进行RT-PCR，结果最小检出的RNA量为3.25pg。（图2略）2.3 重复性试验经在不同时间3次对狂犬病病毒CVS株、8202株和SRV9株的RNA反转录产物进行PCR扩增，

8、结果一致。2.4 应用性试验对36份不同种动物脑组织进行RT-PCR检测，结果同样只产生1条443bp的条带，阴性对照无特异条带，与FAT和MIT检测结果完全吻合。3           讨论本研究对3株狂犬病病毒进行了RT-PCR扩