慢性hcv感染患者pbmc体外th1类细胞因子分泌及其相关因素分析

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1、慢性HCV感染患者PBMC体外Th1类细胞因子分泌及其相关因素分析：李跃旗，许鹏辉，苏海滨，迟淑萍，朱雷，戚扬，李金波，程云【摘要】目的：研究慢性HCV（丙型肝炎病毒）感染患者外周血单个核细胞（PBMC）体外Th1类细胞因子的分泌，进一步了解HCV感染慢性化和肝损伤机制.方法：体外培养慢性HCV感染患者PBMC72h后，ELISA检测培养上清Th1类细胞因子(IL2，IFNγ，TNFα)，荧光定量PCR检测患者血清HCVRNA含量，RTPCR检测HCVRNA亚型.结果：与正常人相比，IFNγ在HCVRNA阴性

2、患者中明显增高，而在RNA阳性患者中无明显升高.TNFα则不论RNA滴度的高低均较正常人显著增高.RNA阳性患者ALT（丙氨酸氨基转移酶），AST（门冬氨酸氨基转移酶）水平明显高于阴性患者.不同HCV基因型感染的患者IFNγ，TNFα的分泌无显著差异.结论：IFNγ在清除病毒中起重要作用，TNFα是引起肝脏损伤的重要因素之一.【关键词】C型肝炎样病毒属　　0引言　　HCV（丙型肝炎病毒）感染后易于慢性化，但其慢性化机制仍不十分清楚.有研究［1-2］表明，天然免疫、体液免疫以及细胞免疫均对病毒的清除有重要作用，

3、而细胞免疫尤为重要.Th1类细胞因子是参与细胞免疫的重要物质，在细胞清除细胞内病原体的免疫应答过程中起关键作用，但同时也是诱发肝脏损伤的重要机制.我们比较了HCV感染后体内不同病毒滴度及不同的基因型患者的外周血单个核细胞（PBMC）体外分泌Th1类细胞因子及肝脏的炎症情况，以进一步了解HCV感染慢性化和肝损伤机制.　　1对象和方法　　1.1对象收集我院2005年门诊或住院的慢性HCV感染患者44（男35，女9）例，平均年龄42.3（15～67）岁，所有病例均符合2000年西安全国第十次病毒性肝炎及肝病学术会议修订的《病

4、毒性肝炎防治方案》慢性HCV感染诊断标准［3］.对照10例为健康献血员.淋巴细胞提取液、Trizol、细胞因子ELISA检测试剂盒（晶美公司）；AMV（逆转录酶），RNA酶抑制剂、dNTP，Taq酶（Promega公司）；RPMI1640母液（Gibico公司）；GeneAMP5700型HCVRNA定量检测仪（美国ABI公司）；AU600肝功能检测仪（Olympus公司）；其他试剂均购自北京中生公司产品.　　1.2方法　　1.2.1外周血PBMC的提取采用Ficoll梯度离心法.　　1.2.2PBMC体外培养后上清细胞

5、因子的检测将分离所得PBMC用含有100mL/L混合人血清的完全RPMI1640培养液稀释细胞密度为5×109/L，以100μL/孔加于96孔板，37℃，50mL/LCO2孵箱中培养，72h后收集培养上清，-20℃冻存.同时设不加细胞的阴性对照和加入ConA(刀豆蛋白，2mg/L)刺激的阳性对照.　　1.2.3检测项目全部病例采用荧光定量PCR检测HCVRNA滴度，肝功能检测由我院临床检验中心完成.　　1.2.4血清HCVRNA基因分型参照文献［4］进行.Trizol提取血清中总RNA，逆转录合成cDNA，引物：5′

6、ATGTACCCCATGAGGTCGGC3′.巢式PCR进行RNA分型鉴定.第1轮PCR引物：正义：5′CGCGCGACTAGGAAGACTTC3′；反义：5′ATGTACCCCATGAGGTCGGC3′，94℃变性1min，55℃复性1.5min，72℃延伸2min，35个循环.第2轮PCR以第1轮PCR产物为模板，使用同一个正义引物和4个型特异性反义引物，正义：5′AGGAAGACTTCCGAGGGGTC3′，反义：5′TGCCTTGGGGATAGGCTGAC3′（Ⅰ型，57bp）；5′GAGC

7、CATCCTGCCCACCCCA3′（Ⅱ型,144bp）；5′CCAAGAGGGACGGGAACCTA3′（Ⅲ型,174bp）；5′ACCCTCGTTTCCGTACAGAG3′（Ⅳ,135bp），94℃变性1min，60℃复性1min，72℃延伸1.5min，30个循环.PCR产物15g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定.　　　　统计学处理：用STATA7.0软件进行统计学处理，两组间比较采用t检验.　　2结果　　2.1HCV感染患者PBMC体外培养72h后Th1类细胞因子的分泌培养72h后，对照及所有HCV患者PBMC

8、培养上清中均未检测到IL2.HCVRNA阴性（RNA<106拷贝/L）患者IFNγ［（55±33）ng/L］较正常人［（34±14）ng/L］和RNA大于109拷贝/L的患者［（29±20）ng/L］明显增高（图1），而所有RNA阳性患者与对照相比无显著差异.TNFα不论RNA滴度高低均较对照显著增高；RNA不同滴度的