慢性hcv感染患者pbmc体外th1类细胞因子分泌及其相关因素分析论文

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1、慢性HCV感染患者PBMC体外Th1类细胞因子分泌及其相关因素分析论文李跃旗，许鹏辉，苏海滨，迟淑萍，朱雷，戚扬，李金波，程云【摘要】目的：研究慢性HCV（丙型肝炎病毒）感染患者外周血单个核细胞（PBMC）体外Th1类细胞因子的分泌.freelega公司）；RPMI1640母液（Gibico公司）；GeneAMP5700型HCVRNA定量检测仪（美国ABI公司）；AU600肝功能检测仪（Olympus公司）；其他试剂均购自北京中生公司产品.1.2方法1.2.1外周血PBMC的提取采用Ficoll梯度离心法.1.2.2PBMC体外培养后上清细胞因子的检测将分离

2、所得PBMC用含有100mL/L混合人血清的完全RPMI1640培养液稀释细胞密度为5×109/L，以100μL/孔加于96孔板，37℃，50mL/LCO2孵箱中培养，72h后收集培养上清，-20℃冻存.同时设不加细胞的阴性对照和加入ConA(刀豆蛋白，2mg/L)刺激的阳性对照.1.2.3检测项目全部病例采用荧光定量PCR检测HCVRNA滴度，肝功能检测由我院临床检验中心完成.1.2.4血清HCVRNA基因分型参照文献［4］进行.Trizol提取血清中总RNA，逆转录合成cDNA，引物：5′ATGTACCCCATGAGGTCGGC3′.巢式PCR进行R

3、NA分型鉴定.第1轮PCR引物：正义：5′CGCGCGACTAGGAAGACTTC3′；反义：5′ATGTACCCCATGAGGTCGGC3′，94℃变性1min，55℃复性1.5min，72℃延伸2min，35个循环.第2轮PCR以第1轮PCR产物为模板，使用同一个正义引物和4个型特异性反义引物，正义：5′AGGAAGACTTCCGAGGGGTC3′，反义：5′TGCCTTGGGGATAGGCTGAC3′（Ⅰ型，57bp）；5′GAGCCATCCTGCCCACCCCA3′（Ⅱ型,144bp）；5′CCAAGAGGGACGGGAACCT

4、A3′（Ⅲ型,174bp）；5′ACCCTCGTTTCCGTACAGAG3′（Ⅳ,135bp），94℃变性1min，60℃复性1min，72℃延伸1.5min，30个循环.PCR产物15g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定.统计学处理：用STATA7.0软件进行统计学处理，两组间比较采用t检验.2结果2.1HCV感染患者PBMC体外培养72h后Th1类细胞因子的分泌培养72h后，对照及所有HCV患者PBMC培养上清中均未检测到IL2.HCVRNA阴性（RNA106拷贝/L）患者IFNγ［（55±33）ng/L］较正常人［（34±14）ng/L］和RNA大于10

5、9拷贝/L的患者［（29±20）ng/L］明显增高（图1），而所有RNA阳性患者与对照相比无显著差异.TNFα不论RNA滴度高低均较对照显著增高；RNA不同滴度的患者间无显著差异.2.2不同HCVRNA滴度情况下患者肝脏功能间的比较RNA阳性患者ALT，AST水平明显高于阴性患者（表1），其余肝脏功能指标两组患者间无明显差异.2.3不同HCVRNA基因型Th1类细胞因子的分泌对34例HCVRNA阳性患者进行HCVRNA分型，21例Ⅱ/1b（62%），5例Ⅲ/2a（15%），8例（23%）未分出（表2）.不论HCVRNA为何种基因型，PBMC体外培养后IFN

6、γ的分泌都较对照组无显著差异，而TNFα则均较对照组明显增高.但各基因型之间IFNγ，TNFα均无显著差异.图1在不同HCVRNA滴度下的PBMCIFNγ和TNFα的分泌水平略表1不同HCVRNA滴度情况下患者的肝脏功能（略）表2不同的HCVRNA基因型Th1类细胞因子的分泌（略）3讨论虽然HCV感染后可诱导机体产生特异性的抗体，但HCV感染仍倾向于慢性化，可能原因是HCV在免疫压力的诱导下中和性表位发生变异，致使已产生的抗体不能中和病毒［5］.因此，细胞免疫在HCV感染后的清除过程中可能起到决定性作用［6］.有研究表明，在感染HCV后自发清除病

7、毒的患者中，其体内Th1类细胞因子（IFNγ，TNFα）的产生显著高于病毒持续存在的患者［7］.此外，在HCV感染后不论是否清除病毒，均可诱导机体产生特异性的细胞免疫，但免疫应答的强度不足以清除病毒，从而致使病毒长期存在［8］.IFNγ主要由NK细胞、CD8+T淋巴细胞、CD4+T淋巴细胞分泌，可增强抗原提呈细胞的吞噬能力，促进MHCI，II类抗原的表达、IL12的分泌，诱导机体免疫应答向Th1类分化［9］,同时其本身也具有抗病毒作用.我们的实验表明，慢性HCV感染患者PBMC体外培养后，在HCVRNA阴性（106拷贝/L）患者中，IFNγ，TNF

8、α的产生明显高于正常人，而在HCVRNA阳性患者中