大豆胚尖遗传转化体系的优化及myb转录因子转基

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1、大豆胚尖遗传转化体系的优化及MYB转录因子转基第一章绪论1.1植物遗传转化技术概述随着植物转基因技术发展以及转基因作物种植面积不断扩大，通过基因工程等方法培育理想性状的新品种大豆也取得了一定的成果。目前，可以应用在遗传转化过程中的转基因方法主要有：农杆菌介导法，花粉管通道法，基因枪法，电激法和聚乙二醇等。应用最普遍的仍然是农杆菌介导法[1]。农杆菌是一种普遍存在于土壤中的革兰氏阴性细菌，这种细菌能在自然状况下大量的感染大多数双子叶植物的伤口，并诱导其产生发状根和冠瘿瘤[2]。目前应用在农杆菌介导法中的主要是根癌农杆菌及发根农杆菌。二者细胞中分别含有Ti质粒，Ri质粒。质粒作

2、用的机制包括4个区域：转移到受体基因组的T-DNA[3]区，与其转移相关的Vir基因区，Con基因区以及Ori基因区[4~6]。在农杆菌侵染植物伤口并进入细胞后，植物伤口所分泌的乙酰丁香酮将作为信号因子诱导Vir基因表达，将农杆菌附着在细胞上。不过这阶段只是停留在细胞间隙当中，T-DNA进一步的加工，剪切和复制后，进入到植物细胞中并整合到植物基因组上，稳定表达。农杆菌介导法的基本步骤：首先构建含有目的基因的载体，将其导入农杆菌菌种中并活化；其次对靶组织进行选择及处理，利用农杆菌侵染，组织筛选，分化及植株的再生；最后将再生植株以及后代进行分子检测和目的性状鉴定。该遗传转化方法

3、技术操作简单，可靠性高，经济成本低，而且外源基因通常是单拷贝插入到植物基因组[7]，转化率比较高且可以转化的基因片段较大，重排现象比较少，遗传稳定性比较好，是大规模转化的最佳方法。..1.2大豆遗传转化的再生系统大豆的组织培养开始于上个世纪60年代，到80年代才开始取得了一些突破性进展。再生体系是遗传转化过程中极为重要的组成部分，其建立及优化是解决遗传转化率低，试验周期长以及嵌合体等问题的主要途径。目前，应用于大豆遗传转化研究中的再生系统主要有三种，包括丛生芽器官发生途径的再生体系、体细胞胚胎发生途径的再生体系和原生质体的再生体系。其中丛生芽器官发生途径的再生体系和体细胞胚

4、胎发生途径的再生体系在实践中应用广泛，发展也比较成熟。早在1988年由Meurer等[20]提出了大豆丛生芽器官发生途径，选用大豆子叶节作为受体材料，在含有高浓度的苄氨基腺嘌呤（BA）培养基上诱导丛生芽，并获得了高频率的再生植株。王萍等[21]、袁鹰等[22]利用子叶节作为受体材料也成功获得再生植株。刘海坤等[23]利用胚尖作为受体材料获得再生植株，并且发现在同样条件下，胚尖作为外植体的再生率远远高于子叶节。程林梅等[24]利用大豆的上、下胚轴等部位作为转化的外植体，并且获得了大豆再生植株。王升吉等[25]将不同基因型的大豆胚轴、子叶、子叶节、顶芽以及叶等分别作为转化的外植

5、体，通过丛生芽器官发生途径的再生体系，成功获得了再生植株，并且对此再生体系的各个阶段所添加的激素作了优化。国内外对丛生芽器官发生途径的再生体系的研究主要集中在组织培养过程中各阶段所用的培养基、在培养基中添加的激素类型和浓度、不同的基因型等因素对体系再生率的影响。研究表明：丛生芽器官发生途径的再生体系多以MS和B5培养基为主；在培养基中添加的激素主要有赤霉素（GA3）、吲哚乙酸（IAA）、6-BA和萘乙酸(NAA)等；不同的激素浓度，所得到的外植体芽诱导率也不相同，大部分低浓度的激素对外植体丛生芽分化有着促进作用，而高浓度的激素就会对丛生芽的分化出现抑制作用；大豆的不同基因型

6、芽诱导率有很大差别，因此，选用再生率相对高的基因型、合适的培养基、激素以及激素浓度对大豆丛生芽器官发生途径的再生体系十分重要。第二章大豆胚尖遗传转化体系的优化2.1材料2.1.1供试材料本试验所选的大豆供试材料主要为吉林35，该材料由吉林大学农学部植物科学学院植物种质资源与利用研究室提供。2.1.2菌株和载体试验中所涉及到的菌株主要为本实验室提供的农杆菌菌株EHA105，所涉及到的植物表达载体为本实验室构建的重组植物表达载体pCB35SR1R2-GFP-MYB12A和pCB35SR1R2-GFP-MYB12B2以及载体pCAMBIA1301。.2.2方法2.2.1胚尖遗传转

7、化体系的操作流程（1）准备农杆菌固体培养基，农杆菌液体培养基，萌发培养基，共培养培养基，重悬液，无菌水，75%酒精；（2）侵染所需单菌落的制备：取原菌液，用烧好的接种环在固体已添加50mg/LKm、50mg/LRif的YEP固体培养基上划线，28℃培养2～3d，当农杆菌单菌落长到合适大小后，放在4℃冰箱保存备用；（3）侵染所需菌液的制备：挑取提前制备好的农杆菌平板上的单菌落，加入到3mL液体已添加50mg/LKm、50mg/Lrif的YEP液体培养基中，28℃，振荡培养，约24h，而后从中吸取适量菌液加入到已添加5