p38 mapk在高糖诱导的肾小管上皮细胞转分化中的作用

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1、p38MAPK在高糖诱导的肾小管上皮细胞转分化中的作用【摘要】目的:探讨p38MAPK在高糖诱导的肾小管上皮细胞转分化中的作用.方法:将体外培养的人肾小管上皮细胞（HK2）分为正常对照组（NG）,高糖组（HG）,无关siRNA转染组（RG）、转染p38MAPKsiRNA24h组(24hG)、转染p38MAPKsiRNA48h组(48hG).免疫细胞化学法检测α平滑肌肌动蛋白(αSMA)和细胞角蛋白(CK)的表达，RTPCR法检测CKmRNA的表达，APK的活化及αSMA的表达.结果:p38MAPKsiRNA能显著抑制高糖诱导的p

2、38MAPK过度活化；高糖刺激后肾小管上皮细胞αSMA蛋白表达明显高于正常组（P<0.05），而p38MAPKsiRNA转染组其水平显著低于高糖组（P<0.05）；高糖诱导HK2细胞CKmRNA和蛋白水平明显降低（P<0.05），而p38MAPKsiRNA转染后其水平显著高于高糖组（P<0.05）；结论:高糖可导致肾小管上皮细胞p38MAPK通路的激活而下调CK，同时导致αSMA蛋白的表达，诱导其表型转化.【关键词】p38丝裂原活化蛋白激酶类；肾小管；上皮细胞；上皮间质转分化0引言糖尿病肾病(DN)是糖尿病

3、的主要微血管并发症，而肾脏纤维化是糖尿病肾病进展为慢性肾功能衰竭的病理基础.研究发现，肾小管上皮细胞转分化为间充质细胞(epithelialmesenchymaltransition,EMT)是肾间质纤维化发生机制之一［1］.p38丝裂素激活蛋白激酶(p38MAPK)是脊椎动物体内广泛存在的丝氨酸／苏氨酸蛋白调节激酶，在糖尿病肾病的发生和发展中发挥重要作用［2-3］.我们应用RNA干扰技术(siRNA)抑制肾小管上皮细胞p38MAPK基因的表达，观察其对高糖诱导的肾小管上皮细胞转分化的影响，以探讨DN肾间质纤维化的机制，为糖尿病肾病

4、的基因治疗提供实验依据.1材料和方法1.1材料人近端肾小管上皮细胞株2(HK2)(美国ATCC).鼠抗人αSMA(美国SantaCruz公司),鼠抗人CK抗体(北京中杉公司),p38和磷酸化p38(Pp38)抗体(cellsignaling公司)，通用型RTPCR试剂盒(日本TaKaRa公司)，LipofectamineTM2000(美国Invitrogen公司).1.2方法1.2.1p38MAPKsiRNA转染人p38特异性siRNA序列：Sense,5′GAAGCTCTCCAGACCATTT3′;Antisense,5′

5、AAATGGTCTGGAGAGCTTCTT3′.用Blast搜寻EST基因库，对选中的siRNA序列同源性分析.将适量HK2细胞接种于培养板，分别转染重组PshRNAp38MAPK和无关对照质粒，依LipofectamineTM2000转染试剂盒说明书进行操作.1.2.2细胞培养及分组HK2用含100mL/LFCS的DMEM培养液传代培养.分为5组：①正常对照组(NG):培养液中含D葡萄糖(5.5mmol/L);②高糖组(HG):培养液中含D葡萄糖(30mmol/L);③无关siRNA转染组(RG):无关pshGSP转染细胞2

6、4h后,再给予D葡萄糖(30mmol/L);④转染p38MAPKsiRNA24h组(24hG):pshRNAp38MAPK转染细胞24h后，再给予D葡萄糖(30mmol/L);⑤转染p38MAPKsiRNA48h组(48hG):pshRNAp38MAPK转染细胞48h后，再给予D葡萄糖(30mmol/L).每组均加入等量脂质体，给予D葡萄糖作用48h后收集细胞和培养液用于各项检测.各组细胞分别用相差显微镜和透射电镜进行观察.1.2.3免疫细胞化学法检测CK和αSMA表达HK2细胞爬片，待细胞长至亚融合状态，以无血清培养

7、基继续培养24h使其同步化，分组如前述.根据SP试剂盒所示方法检测CK，αSMA的表达.生物医学图像分析系统进行图像分析，用平均吸光度表示阳性物质的相对含量.1.2.4RTPCR实验各组按照Trizol说明书提取总RNA，根据260nm吸光度值计算RNA浓度.取总RNA1μg作逆转录，步骤参照试剂盒说明.CK引物正义链：5′CCCAGAGCCTTGAGATAGAAC3′，反义链:5′CACGACCTTGCCATCCAC3′.βactin引物正义链5′CACCAACTGGGACGACAT3′，反义链:3′GCAACGA

8、TAGGTCCGACA5′.反应参数:变性94℃2min，变性94℃30s，退火55℃30s，延伸72℃2min，35个循环.PCR产物琼脂糖凝胶电泳，CKmRNA表达以βactin作为内参照物调整后进