分子生物学研究法.ppt

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1、分子生物学基本研究法（上）DNA、RNA及蛋白质操作技术第五章扉页：当你进入实验室时，要像脱去外衣那样放下你的想象力，因为实验操作中不能有一丁点儿的想象，否则，你对事物的观察就会受影响；当你翻开书本的时候，你又必须尽可能展开想象的“翅膀”，否则，你就不可能走在别人的前面。RNA基本操作技术真核生物基因组DNA庞大，有大量重复序列，很难直接分离得到靶基因片段。而cDNA来自反转录的mRNA，无冗余序列，通过筛选cDNA文库，可较快地分离到相关基因。5.3RNA基本操作技术5.3.1总RNA的提取5.3.2mRNA的纯化5.3.3cDNA的合成5.3.4cDNA文库的构建5.

2、3.5基因文库的筛选5.3.1总RNA的提取细胞中的总RNA包括：mRNA1%~5%rRNA80%~85%tRNAsRNA15%~20%Trizol总RNA提取试剂TIANGENrRNA电泳后的三条特征性条带28S、18S、5S(特别是28S和18S特征性条带)是鉴定总RNA纯度和完整性的重要参数。RNA的抽提方法1.实验室常用方法：异硫氰酸胍－苯酚抽提法Trizol试剂：苯酚和异硫氰酸胍组成，可迅速破坏细胞结构，释放细胞质及细胞核中的RNA，并使核糖体蛋白与RNA分子分离，还能保证RNA的完整。Trizol提取步骤：首先在液氮中研磨材料，匀浆，加入trizol试剂，再加

3、入氯仿抽提，分离水相，异丙醇沉淀。RNAExtractionbyTRIzol使用BioSpcetrometer分光光度计进行快速检测核酸mRNAExtractionfromCellCulturemRNAExtractionfromTissue2.硅胶膜纯化柱法将含有目的RNA的细胞破碎液通过该柱，RNA吸附在硅胶膜上，然后在低盐浓度下可从硅胶上直接洗脱RNA。RNA的浓度和纯度的判断：可通过测定其OD260和OD280OD260＝1时，相当于浓度为40μg/mL，当OD260/OD280＝1.8～2.0时，说明RNA纯度较好。5.32.mRNA的纯化寡聚（dT）－纤维素柱

4、色谱法：利用mRNA3’端含有PolyA+的特点，当RNA流经寡聚dT纤维素柱时，在高盐缓冲液的作用下，mRNA被特异性地结合在柱上，再用低盐溶液或蒸馏水洗脱mRNA。经过两次此柱可得到较高纯度的mRNA.PromegaPolyATtractmRNA分离系统分离多聚(A)mRNA。将用生物素标记的寡聚(dT)引物与细胞总RNA共温育，加入与微磁球相连的抗生物素蛋白，用磁场吸附通过寡聚(dT)引物与抗生物素蛋白及强力微磁球相连的mRNA。图5-14PolyATtractmRNA的分离纯化过程简图。每个OligotexKit包括用于结合polyA+mRNA的Oligotex树

5、脂，和用于洗涤、洗脱结合的mRNA的离心柱。OligotexmRNAKits可从总RNA中纯化mRNA，回收polyA+体外转录子。OligotexDirectmRNAKits可从细胞和组织中纯化mRNA。mRNAExtractionfromTotalRNA5.3.3cDNA的合成cDNA（complementaryDNA）：在体外以mRNA为模板，利用反转录酶和DNA聚合酶合成的一段双链DNA。图5-15cDNA合成过程示意图。第一链cDNA的合成：以mRNA为模板，反转录成cDNA，由反转录酶催化，需引物（常用oligodT）。第二链cDNA的合成：以第一链为模板，由

6、DNA聚合酶催化。图5-16cDNA合成中的分子修饰。cDNA的合成5.3.4cDNA文库的构建cDNA文库：是指将某种生物体基因组转录的全部mRNA经反转录产生的cDNA片段分别与克隆载体重组，储存于某种受体菌中，该群体就称该生物基因组的cDNA文库。构建cDNA文库的基本程序：①mRNA的提取和纯化。②合成cDNA第一链。③将mRNA-cDNA杂交分子转变为双链cDNA分子。④将双链cDNA重组到噬菌体载体或质粒载体上。⑤将重组子体外包装成具有感染力的噬菌体颗粒导入到大肠杆菌寄主细胞中增殖。构建基因组文库的基本程序：构建基因组文库的基本程序：构建基因组文库的基本程序：

7、基因文库的建立基因组DNA文库cDNA文库基因组DNA文库与cDNA文库的比较基因组文库与cDNA文库的差别基因组文库中包含了所有基因，而cDNA文库只包含表达的基因，缺乏内含子和调控序列，在研究基因结构时用处不大cDNA文库代表了mRNA的来源，转录本在丰度上有差别，而基因组文库在理论上均等地代表了所有基因序列不同细胞类型制备的cDNA文库包含一些共同序列和独特序列，可用于分离差别表达的基因，基因组文库中不能基因组文库由于含有不表达序列，比cDNA文库大mRNA在不同组织之间存在丰度差异，因此cDNA文库在构建时对于mRNA