质粒DNA的提取、酶切与鉴定.doc

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5、变性的质粒DNA又恢复原来的构型，保存在溶液中，而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。[试剂]1.溶液I：50mmol/L葡萄糖、10mmol/LEDTA、25mmol/LTris-HClpH8.0;用前加溶菌酶4mg/ml。2.溶液II：200mmol/LNaOH、1%SDS。3.溶液III：pH4.8醋酸钾缓冲液（60ml5mol/L醋酸钾、11.5ml冰醋酸、28.5ml蒸馏水）4.TE缓冲液pH8.05.含RNaseA的TE缓冲液：TE缓冲液含20μg/mlRNa

6、seA。6.苯酚：氯仿（1：1，v/v）：酚需在160℃重蒸，加入抗氧化剂8-羟基喹啉，使体积分数为0.1%，并用Tris-HCl缓冲液平衡两次。氯仿中加入异戊醇，氯仿/异戊醇为24：1（v/v）。7.1×LB溶液8.100μg/ml氨苄青霉素[器材]1.TGL-16型台式高速离心机2.1.5ml塑料离心管3.离心管架4.微量移液器5.常用玻璃器皿[操作步骤]1.培养细菌将带有质粒pUC19的大肠杆菌接种于5ml含100μg/ml氨苄青霉素的1×LB中，37℃培养过夜。2.取液体培养菌液1.5ml置塑料离心管中，10000r/min离心lmin，去掉上清液。加入15

7、0μl溶液I，充分混匀，在室温下放置10min。3.加入200μl新配制的溶液II，加盖后温和颠倒5~10次，使之混匀，冰上放置2min。4.加入150μl冰冷的溶液III，加盖后温和颠倒5~10次，使之混匀，冰上放置10min。5.用台式高速离心机，10000r/min离心5min，将上清液移入干净的离心管中。6.向上清液中加入等体积酚/氯仿（1：1，v/v），振荡混匀，转速10000r/min，离心2min，将上清液转移至新的离心管中。7.向上清液加5mol/LNaCl至终浓度为0.3mol/L，混匀，再加入2倍体积无水乙醇，混匀，室温放置2min，离心5m