琼脂糖凝胶电泳课件.ppt

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1、DNA/RNA的琼脂糖凝胶电泳实验原理实验仪器、材料与试剂实验步骤注意事项与实验技巧凝胶电泳是分离和纯化DNA片段最常用的技术；分离、鉴定和提纯核酸首选的标准方法。根据制备凝胶的材料:琼脂糖电泳凝胶电泳聚丙烯酰胺电泳一、实验原理（1）某物质在电场作用下的迁移速度叫做电泳的速率，电泳的速率与核酸分子大小和构型有关。DNA分子在碱性缓冲液中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动。分子质量越小跑得越快，紧密构型快于松散型开环分子或线性分子，从而可以分离大小不同的DNA或RNA分子。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应。不同DNA的分子量大

2、小及构型不同，电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带。（2）琼脂糖是一种线性多糖聚合物，可以形成具有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度。浓度越高，孔隙越小，其分辨能力就越强。分离长度凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳200bp—近50kb聚丙烯酰胺凝胶电泳5—500bp分辨率高采用不同浓度的凝胶可以分辨范围广泛的DNA分子。含不同量琼脂糖的凝胶的分离范围凝胶中的琼脂糖含量[%（W/V）]DNA/RNA分子的分离范围（kb）0.35—600.61—200.70.8—100.90.5—71.20.4—61.50.2—320.1—2二、实验仪器、材料与试

3、剂质粒样品、酶切样品和PCR样品。凝胶电泳系统和电泳图像分析系统(凝胶成像系统)等。琼脂糖、1XTAE电泳缓冲液、溴化乙锭、6X载样缓冲液（6Xloadingbuffer）和DNA分子量标准等。凝胶电泳系统DYY-6C型 双稳定时电泳仪电源（北京六一）输出范围（显示分辨率）：6-600V(1V)     4-400mA (1mA)     240W美国Bio-rad伯乐小型水平电泳槽Mini-SubCellGTCell凝胶成像分析系统DNAMarker一个已知分子质量的DNA样品做对照，用来确定待测样品的相对分子质量。常用电泳缓冲液缓冲液缓冲容量迁

4、移速度分辨率用途TAE最低最快(高10％)高分子量高高度复杂DNA混合物；超螺旋DNATBE很高较慢低分子量高价格昂贵，不常用TPETris-硼酸（TBE）Tris-乙酸（TAE）Tris-磷酸（TPE）DNA的泳动受到电泳缓冲液和离子浓度的影响。缺乏离子，电导率严重降低，电泳迁移率很慢；离子强度过高，电导率升高，极易产生大量的热能，最严重的结果是凝胶熔化，DNA变性。常用的电泳缓冲液有TAE，TPE和TBE，其中TAE的缓冲容量最低，长时间电泳将被消耗。上样缓冲液电泳指示剂溴酚兰在碱性液体中呈紫兰色，一般与蔗糖、甘油或聚蔗糖400组成上样缓冲液。

5、作用：①增加样品比重，以确保DNA均匀沉入加样孔内。②形成肉眼可见的指示带，预测核酸电泳的速度和位置。③使样品呈色，使加样操作更方便。EB染料溴化乙锭（EB）是一种高度灵敏的荧光染色剂，它在标准的302mm紫外光照射下能发射橙红色信号，当DNA样品在琼脂糖凝胶中电泳时，琼脂糖凝胶中的EB就插入DNA分子中形成荧光络合物，使DNA发射的荧光增强几十倍，电泳后就可直接紫外灯照射下检测琼脂糖中的DNA。EB染料优点：染色操作简便，快速，室温下15-20min；不会使核酸断裂；灵敏度高，10ng或更少的DNA即可检出，效果较好；可以加到样品中或胶中。EB是

6、诱变剂，有剧毒，使用时一定要戴手套，且一定要注意等到琼脂糖凉到四十多度的时候再加EB，否则EB有一定的挥发性，而鼻黏膜对EB的吸收是较明显的。EB废液要经过净化处理再行弃置。SYBR:新型低毒，高灵敏度染料，但操作不便，信号不稳定，易猝灭，价格较昂贵。Goldview:主要成分吖啶橙，高毒，在相当程度导致细胞凋忘。较便宜，但效果不及EB。三、实验步骤1.制备琼脂糖凝胶（1%）2.制备凝胶板3.加样4.电泳5.染色6.结果观察二、实验方法1．50×TAE的稀释：如制备50mL1×TAE，取1mL50×TAE加入49mL水定容至50mL。2．制备1%的

7、琼脂糖胶液：取0.2g琼脂糖溶于20mLTAE中，在短时间里加热琼脂糖全部熔化，使溶液冷却至40℃.(加入浓度为10mg/mL的EB2μL，使EB的终浓度为1μg/mL)。3．用于RNA电泳的电泳槽用去污剂洗干净，再用水冲洗，用乙醇干燥后灌满3%的H2O2溶液，于室温放置10分钟，然后用DEPC—SDW冲洗电泳槽，梳子同样处理。4．用胶带封住胶床，放好梳子。5．将温热琼脂糖倒入胶床中，凝胶的厚度在3—5mm之间，凝固20—60min。6．在凝胶完全凝固之后，小心移去梳子，将胶床放在电泳槽内，加样孔一侧靠近阴极（黑极）。7．向电泳槽中注入适量的TAE

8、缓冲液，通常缓冲液高于胶面1cm。8．分别将DNA/RNA样品与加样缓冲液混合,用移液枪将样品加入加样孔。9．正确连接电泳