dnaran琼脂糖凝胶电泳课件

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1、核酸的提取及琼脂糖凝胶电泳目录核酸组成理化性质核酸分离、纯化的原则核酸提取的基本步骤材料准备细胞裂解分离、纯化沉淀溶解DNA提取的常用方法RNA提取的常用方法核酸的保存琼脂糖凝胶电泳核酸DNARNAGenomicDNA(原核、真核、病毒)细胞器DNA(叶绿体、线粒体等)质粒DNA(细菌、放线菌等)mRNA(1%-5%)rRNA(80%-85%)tRNA(小分子RNA)(15%-20%)核酸(nucleicacid)核酸的提取是分子生物学实验技术中最重要、最基本的操作。核酸的理化性质理化性质DNA化学性质稳定，物理上易碎，粘度大RNA化学性

2、质比DNA活泼，易受RNA酶的污染溶解性均溶于水不溶于一般有机溶剂,在70%乙醇中形成沉淀核酸分离、纯化原则1、保持核酸分子一级结构的完整性温度不要太高控制pH值范围(pH值5-9)保持一定离子强度减少物理因素对核酸的机械剪切力核酸分离、纯化原则核酸酶能消化核酸链中的磷酸二酯键，破坏核酸一级结构。所用器械和一些试剂需高温灭菌提取缓冲液中需加核酸酶抑制剂2、防止核酸的生物降解DNA酶抑制剂金属离子螯合剂：DNA酶需要金属二价离子Mg2+、Ca2+的激活，常用EDTA(乙二胺四乙酸)离子螯合剂，可抑制DNA酶活性。阴离于型表面活性剂SDS除对

3、核酸酶有抑制作用外，还能使蛋白质变性，并与变性蛋白结合成带负电荷的复合物，该复合物有核酸酶抑制剂作用。RNA酶（RNAase)抑制剂DEPC(二乙基焦碳酸盐)粘性液体，很强的核酸酶抑制剂。与蛋白质中His结合使蛋白变性。使用注意：1.DEPC也能破坏单链核酸中大部分腺嘌呤环。2.容易降解，保存在4℃或液氮中；3.剧毒。1：手指头2：枪头3：水/缓冲液4：实验台面5：内源Rnase6：RNA样品7：质粒抽提8：RNA保存9：阳离子(Ca,Mg)10：后续实验所用的酶Rnase污染的10大来源DNA提取的基本步骤I.材料准备II.裂解III.

4、分离、纯化IV.沉淀或吸附核酸V.溶解材料准备使用新鲜材料，样品材料不要反复冻融提取血液基因组DNA时，要选择有核细胞（白细胞）含病毒的液体材料DNA含量较少，提取前先富集基因组DNA的提取细胞裂解裂解液经典的裂解液几乎都含有去污剂和盐，可以抑制样品中的核酸酶含蛋白酶的裂解方法：基因组DNA高浓度蛋白变性剂的裂解方法：RNA含CTAB的裂解法：富含多糖的样品的基因组DNA含SDS碱裂解法：质粒DNA核酸分离、纯化蛋白质的去除：酚/氯仿抽提使用变性剂变性（SDS、异硫氰酸胍等）高盐洗涤核酸-蛋白质加入NaCl后，破坏静电吸力，使氢键破坏，核

5、蛋白解聚；蛋白酶处理核酸分离、纯化多糖的去除：高盐法：用乙醇沉淀时，在待沉淀溶液中加入1/2体积的5MNaCl，高盐可溶解多糖。用多糖水解酶将多糖降解。在提取缓冲液中加一定量的氯苯，氯苯可以与多糖的羟基作用，从而去除多糖。核酸沉淀、溶解重新调整核酸的浓度；去除溶液中某些盐离子与杂质。乙醇优点：对盐类沉淀少，沉淀中所含乙醇易挥发除去，不影响以后实验。缺点：需要量大，一般要求低温操作。异丙醇优点：需体积小，速度快，适于浓度低、体积大的DNA样品沉淀。一般不需低温。缺点：易使盐类、蔗糖与DNA共沉淀．异丙醇难以挥发除去。所以，最后用70％乙醇漂

6、洗。有机沉淀剂核酸的保存(1)对DNA①DNA样品溶于pH8.0的TE，4℃或-20℃保存；②长期保存样品中可加入1滴氯仿。(2)对RNA①RNA样品溶于0.3mol/LNaAc(pH5.2)或双蒸灭菌水中，-70℃保存;②长期保存可以沉淀形式贮于乙醇中;DNA提取的常用方法基因组DNA的提取SDS法其它原理基因组DNA－SDS法SDS在高温（55～65℃）条件下能裂解细胞，使染色体离析，蛋白变性，释放出核酸；上清液中的DNA用酚/氯仿抽提，反复抽提后用乙醇沉淀水相中的DNA。组份Tris-HCl（pH8.0）EDTA（pH8.0）NaC

7、lSDS终浓度100mM20mM1.4M2%(W/V)SDS提取缓冲液的配方Tris-HCl（pH8.0）提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏；EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase活性；NaCl提供一个高盐环境，使DNA充分溶解，存在于液相中；SDS裂解细胞，使蛋白变性，染色体离析；吸附材料结合法：根据核酸分离纯化方式的不同有：高盐低pH值结合核酸，低盐高pH值洗脱。快捷高效。低盐高pH值结合核酸，高盐低pH值洗脱。适用于纯度要求高的实验。磁性微粒挂上不同基团可吸附不同的目的物，从而达到分离目的。其他方法硅质材料阴离子交换树脂磁

8、珠低盐高pH值结合核酸，高盐低pH值洗脱。适用于纯度要求高的实验。阴离子交换树脂磁珠低盐高pH值结合核酸，高盐低pH值洗脱。适用于纯度要求高的实验。阴离子交换树脂磁性微粒挂上不同基团可吸附不同