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时间:2018-07-30
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1、DNA琼脂糖凝胶电泳一、简介带电荷的物质在电场中的趋向运动称为电泳。电泳的种类多,应用非常广泛,它已成为分子生物学技术中分离生物大分子的重要手段。琼脂糖凝胶电泳由于其操作简单、快速、灵敏等优点,已成为分离和鉴定核酸的常用方法。二、实验材料质粒DNA、基因组DNA或它们的酶切产物、琼脂糖、溴化乙锭(EB)、上样缓冲液、TAE电泳缓冲液(Tris(三羟甲基氨基甲烷),NaAc,EDTA)。三、实验原理在pH值为8.0~8.3时,核酸分子碱基几乎不解离,磷酸全部解离,核酸分子带负电,在电泳时向正极移动。采
2、用适当浓度的凝胶介质作为电泳支持物,在分子筛的作用下,使分子大小和构象不同的核酸分子泳动率出现较大的差异,从而能达到分离核酸片段检测其大小的目的。核酸分子中嵌入荧光染料(如EB)后,在紫外灯下可观察到核酸片段所在的位置。四、实验步骤1.称取1g琼脂糖,加入到100mlTAE中,在微波炉中加热使琼脂糖颗粒完全溶解,冷却至50-60ºC时,加入4μlEB溶液,轻轻摇晃,混匀。2.待凝胶液冷至50ºC左右时,倒入凝胶槽,凝胶厚度一般为5~8mm。3.在凝胶槽中放入梳子,注意调节好梳子之间的距离。4.待凝胶
3、成形后,小心拔出梳子,用刀片将凝胶与凝胶槽之间小心地分离,小心取出凝胶,放入盛有电泳缓冲液的电泳槽中。若电泳缓冲液不足,可加入适量电泳缓冲液,使电泳缓冲液液面高出凝胶2~3mm。5.用移液枪取5μl待测DNA样品,与上样缓冲液混合均匀,小心地加入到凝胶上样孔中。6.打开电泳仪,插好导线,电压110V,电泳20min。也可根据指示染料移动的位置,确定电泳是否终止。7.电泳完成后切断电源,取出凝胶,置于紫外透射仪上观察电泳结果,并照相记录。五、注意事项1.影响DNA片段琼脂糖电泳的几个因素:(1)DNA
4、分子的大小:线性DNA分子的迁移率与其分子量的对数值成反比。(2)琼脂糖浓度:一定大小的DNA片段在不同浓度的琼脂糖凝胶中的迁移率是不相同的。相反,在一定浓度的琼脂糖凝胶中,不同大小的DNA片段的迁移率也是不同的。若要有效地分离不同大小的DNA,应采用适当浓度的琼脂糖凝胶。琼脂糖凝胶浓度可分辨的线性DNA片段大小(kb)0.45~600.70.8~101.00.4~61.50.2~41.750.2~32.00.1~3(3)DNA构象:一般迁移速率超螺旋环状DNA>线状DNA>单链开环DNA。当条件变
5、化时,情况会相反,还与琼脂糖的浓度、电流强度、离子强度及EB含量有关。(4)电流强度:每厘米凝胶电压不超过5V,若电压过高分辨率会降低,只有在低电压时,线性DNA分子的电泳迁移率与所用电压成正比。(5)嵌入染料的存在会降低线性DNA迁移率,所以不提倡将嵌入染料加在电泳缓冲液中。(6)电泳缓冲液的组成及其离子强度影响DNA的迁移率,无离子存在时,核酸基本不泳动,离子强度过大产热厉害,熔化凝胶并导致DNA变性,一般采用1×TAE,1×TBE,1×TPE(均含EDTA,pH8.0)。2.溴化乙锭(EB)为
6、致癌剂,操作时应戴手套,尽量减少台面污染。3.电泳指示剂:核酸电泳常用的指示剂有两种,溴酚蓝(bromophenolblue,Bb)呈蓝紫色;二甲苯晴(xylenecyanol,Xc)呈蓝色。二甲苯晴携带的电荷量比溴酚蓝少,在凝胶中的迁移率比溴酚蓝慢。附:50×TAE电泳缓冲液贮存液配方:(50×)每升242gTris57.1ml冰醋酸100ml0.5mol/LEDTA(pH8.0)几个相关化合物的结构式TrisEDTAEB琼脂糖聚合物
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