dna琼脂糖凝胶电泳

《dna琼脂糖凝胶电泳》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。

1、分子醫學技能DNA瓊脂糖凝膠電泳一、實驗目的和應用價值1.分析PCR產物2.分析基因多態性3.掌握DNA電泳技術二、實驗原理在pH8.0(鹼性)的環境中，DNA的磷酸基因解離，使DNA在該環境中帶上負電荷，在電場中向正極方向泳動，因為各種DNA分子的電荷數、構象、分子量不同，他們在通過凝膠立體網絡時所受的動力和阻力不同，所以泳動的速度有差異，達到分離的目的。三、實驗基本流程和注意事項瓊脂糖凝膠板的製備(封板、梳子位置與高度、凝固後拔梳)→倒緩衝液，加樣(樣品中加入1/5體積的上樣buffer)→電泳(

2、方向、電壓、時間)→染色與檢測(EB10分鐘，紫外檢測)四、實驗結果與討論DesignbyCeciliaLee分子醫學技能＊瓊脂糖凝膠的特點瓊脂糖凝膠是依靠糖分子上的羥基由於氫鍵的作用相互連接，形成三微空間結構，結構的疏密由瓊脂糖的濃度決定。瓊脂糖凝膠在36~40℃下開始凝固，約一小時候就會出現裂痕，若要妥善保存，應用保鮮膜覆蓋，保存於4℃冰箱。瓊脂糖中常見的雜質是硫酸鹽、丙酮酸鹽等，這些雜質除了會影響凝膠的融化與凝結溫度外，還會產生「電滲作用」(electroosmosis)，降低電泳的解析度。＊如

3、何提高核酸電泳的解析度？1.提高瓊脂糖的濃度減小凝膠孔徑來提高電泳解析度2.改用聚丙烯醯胺凝膠3.降低跑電泳的電壓，增大跑電泳的時間＊影響DNA在凝膠中遷移速率的因素1.DNA分子的相對分子質量：雙鏈線狀DNA分子遷移的速率與其鹼基對數值近似成反比。樣品分子越大，在通過膠孔時的摩擦阻滯力越大，泳動速度越慢。2.構象：共價閉環DNA分子＞直線DNA分子＞開環雙鏈DNA分子3.凝膠濃度：濃度越低，相同核酸分子遷移越快。凝膠濃度愈低，則凝膠孔徑愈大(但凝膠的強度也愈低)。一般地分子量越大，選用的凝膠濃度應越

4、小。4.電壓:低電壓時DNA片段遷移率與所用電壓成正比。但隨著電壓上升，不同長度DNA泳動的增加程度不同，解析度會降低5.離子強度：緩衝液中無離子時，DNA幾乎不移動。而在高離子強度下，導電性極高，帶電顆粒泳動很快，並產生大量的熱，有時甚至熔化凝膠或使DNA變性＊溴化乙錠是一種核酸染料，常在瓊脂糖凝膠電泳中用於核酸染色。在標準302nm紫外光的照射下，未與核酸結合的溴化乙錠可被激發出橙紅色螢光，在與DNA或雙股RNA結合時，螢光強度會增強20倍，使得核酸電泳後的膠片可以辨識核酸的相對位置。溴化乙錠含有

5、一個可以嵌入DNA堆積鹼基之間的一個三環平面基團。它與DNA的結合幾乎沒有鹼基序列特異性。在高離子強度的飽和溶液中，大約每2.5個鹼基插入一個溴化乙錠分子。當染料分子插入後，其平面基團與螺旋的軸線垂直並通過範德華力與上下鹼基相互作用。這個基團的固定位置及其與鹼基的密切接近，導致與DNA結合的染料呈現螢光，其螢光產率比遊離溶液中染料有所增加。DNA吸收254nm處的紫外輻射並傳遞給染料，而被結合的染料本身吸收302nm和366nm的光輻射。這兩種情況下，被吸收的能量在可見光譜紅橙區的590nm處重新發射

6、出來。由於溴化乙錠-DNA複合物的螢光產率比沒有結合DNA的染料高出20-30倍，所以當凝膠中含有遊離的溴化乙錠（0.5ug/ml）時，可以檢測到少至10ng的DNA條帶。＊完成基因克隆技術最重要的要素DesignbyCeciliaLee分子醫學技能將外源基因通過體外重組後導入受體細胞，使該基因能在受體細胞內複製、轉錄、翻譯和表達，整個操作稱為基因重組技術。要實施該技術必須具備四大要素：工具酶、載體、基因和受體（宿主）細胞。1.工具酶：基因是一段具有一定功能的DNA分子，要把不同基因的DNA線形分子片

7、段準確地切出來，需要各種限制性核酸內切酶；要把不同片段連接起來，需要DNA連接酶；要合成基因或其中的一個片段，需要DNA聚合酶等。因此，酶是DNA重組技術中必不可少的工具，基因工程中所用的酶統稱為工具酶。工具酶就其用途而言可分為三大類：限制性內切酶、連接酶和修飾酶。基因重組正是利用了這些工具酶對DNA分子進行一系列的酶催化反應，才得以在體外實現DNA分子的切割和連接。2.載體（Vectors）：一種能夠結合外源DNA片段形成重組DNA，並能進行自我複製的DNA分子稱為載體。載體的具體種類有：質粒、噬菌

8、體、病毒、人工染色體，分別應用於原核細胞或真核細胞。從功能來分，有克隆載體（構建基因組文庫或cDNA文庫）、測序載體、表達載體以及能在兩個不同物種中存在的穿梭質粒。隨著生物技術的發展和科學研究的深入，不斷出現具有不同功能的新載體，如可以容納幾百萬鹼基的酵母人工染色體。3.基因：得到多拷貝目的基因或外源基因並獲得表達是克隆的根本目的，但首先要得到含有該基因的範本，因此分離原始基因是必要的。基因的來源一般可以從以下幾個途徑獲得：染色體DNA、RNA、化學合成