琼脂糖凝胶电泳检测dna

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时间:2018-10-06

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1、实验10琼脂糖凝胶电泳检测DNA一、实验原理DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷,在电场中向正极移动。由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质,相同数量的双涟DNA几乎具有等量净电荷,因此它们能以同样的速度向正极方向移动。在一定的电场强度下,DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应,即DNA分子本身的大小和构型。一、实验原理具有不同的相对分子质量的DNA片段泳动速度不一样,可进行分离。DNA分子的迁移速度与相对分子质量的对数值成反比关系。凝胶电泳不仅可分离不同相对分子质量的DNA,也可以分离相对分子质

2、量相同,但构型不同的DNA分子。二、实验仪器1.恒温培养箱2.琼脂糖凝胶电泳系统3.台式离心机4.高压灭菌锅5.紫外线透射仪6.凝胶成像系统三、实验试剂1.Loadingdye(0.25%溴酚兰+40%蔗糖水溶液)10ml需0.025g溴酚兰和4g蔗糖2.EB:需1g溴化乙锭3.TBE:5×TBE贮液2L:108gTris-base、55g硼酸、40ml0.5M的EDTA(pH8.0)需7.4gdisodium·2H2O4.琼脂糖:30g四、实验步骤1.用胶带将洗净、干燥的制胶板的两端封好,水平放置在工作台上;2.调整好梳子的高度;3.称取0.24g

3、琼脂糖于30ml0.5×TBE中,在微波炉中使琼脂糖颗粒完全溶解,冷却至45-50ºC时倒入制胶板中;4.凝胶凝固后,小心拔去梳子,撕下胶带;四、实验步骤5.将电泳样品与溴酚蓝混合后将样品依次点入加样孔中;DNA5µl+ddH2O3µl+溴酚蓝2µl共10µl于0.5mltube中混合后点样;6.将制胶板放入电泳槽中,加入电泳液,打开电泳仪,使核酸样品向正极泳动;7.电泳完成后切断电源,取出凝胶,放入0.5µg/ml的溴化乙锭(EB)溶液中染色10-15min,清水漂洗后置于紫外透射仪上观察电泳结果,并照相记录。五、主要事项1.影响DNA在琼脂糖凝胶

4、中迁移速率的因素:a.DNA分子大小迁移速率U与logN成反比(N为碱基对数目)。分子大小相等,电荷基本相等(DNA结构重复性)。分子越大,迁移越慢。等量的空间结构紧密的电泳快(超螺旋>线性DNA)b.琼脂糖浓度:logU=logU0Kr胶浓度,U为迁移率,U0为DNA的自由电泳迁移率,为胶浓度,Kr为介质阻滞系数。不同的凝胶浓度,分辨不同范围的DNAAgarose:0.5%:1-30kb;0.7%:0.8-12kb1.2%:0.4-7kb;1.5%:0.2-3kb五、主要事项c.DNA构象:一般迁移速率超螺旋环状>线状DNA>单链开环。当条件变

5、化时,情况会相反,还与琼脂糖的浓度、电流强度、离子强度及EB含量有关。d.所加电压:低电压时,线状DNA片段的迁移速率与所加电压成正比。使分辨效果好,凝胶上所加电压不应超过5V/cm五、主要事项e.碱基组成与温度:一般影响不大4-30℃f.嵌入染料的存在:降低线性DNA迁移率,(不提倡加在电泳液中)g.电泳缓冲液(0.5×TBE)的组成及其离子强度影响DNA的迁移率,无离子存在时,核酸基本不泳动,离子强度过大产热厉害,熔化凝胶并导致DNA变性,一般采用1×TAE,1×TBE,1×TPE(均含EDTApH8.0)。五、主要事项2.溴化乙锭(EB)为致癌

6、剂,操作时应戴手套,尽量减少台面污染。3.电泳指示剂:核酸电泳常用的指示剂有两种,溴酚蓝(bromophenolblue,Bb)呈蓝紫色;二甲苯晴(xylenecyanol,Xc)呈蓝色,它携带的电荷量比溴酚蓝少,在凝胶中的的迁移率比溴酚蓝慢。六、思考题1、DNA在电场中的迁移率取决于哪些因素?2、琼脂糖凝胶有哪些注意事项?

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