叶绿体DNA的提取-微藻.doc

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1、叶绿体DNA的提取（参考杜氏盐藻）1、材料：扁藻2、培养基配方：3、仪器：超速离心机细胞破碎仪4、用于细胞破碎和叶绿体分离的缓冲液：溶液1：0.33mol/L山梨糖醇Sorbitol，50mmol/LHepes,2mmol/LEDTA,1mmol/LMnCl2,2mmol/LDTT,体积分数0.5%BSA，Leupeptin1mg/L溶液2（45%蔗糖加离心缓冲液）：45g/L蔗糖，0.33mol/LSorbitol，50mmol/LHepes溶液3（60%蔗糖加离心缓冲液）：60g/L蔗糖，0.33mol/LSorbitol，50mmol/L

2、Hepes溶液4（叶绿体洗涤缓冲液）：0.33mol/LSorbitol，25mmol/LHepes以上缓冲液均用KOH调pH至7.5溶液5：50mmol/LTris-HCl，100mmol/LEDTA，pH8.05、完整叶绿体的分离（所有操作均在4℃进行）1）将培养10d左右达对数生长后期的250ml藻液，离心收集藻体，液氮充分研磨后，将上述藻体细胞用20ml冰预冷的溶液1充分缓慢的悬浮于50ml离心管，制成（粗体液）。3）将粗体液于1000g离心30s，弃上清。4）再次用10ml冰预冷的溶液1充分缓慢悬浮，悬浮液平均铺满于6个10mLHIT

3、ACHICPIO0专用离心管上层，每个离心管最下层铺有冰预冷的3mL溶液3，其上铺有冰预冷的3mL溶液2形成梯度。5）4℃,40000g离心3h，完整的叶绿体集中在梯度之间，将此层小心吸至10mL离心管(约2mL)6）加入4倍体积的冰预冷的溶液4，3000g离心5min以除去多余的蔗糖，重复此步骤1次。7）将沉淀悬浮于3mL溶液4作为完整叶绿体制品，置于4℃备用。6、cpDNA的提取及鉴定l）在得到的新鲜完整叶绿体制品中，加入终浓度分别为150μg/l和13mmol/l的DNaseI和MgCl2，并于冰上静置2h以去除来自核DNA的潜在污染2）

4、4℃,1000g离心1min，收集叶绿体沉淀3）将叶绿体沉淀悬浮于500μl溶液5，加入终浓度为2%的SDS(初始浓度为20%的SDS加55μl)和终浓度为100μg/ml的蛋白酶K（初始浓度为20mg/ml，加2.7μl），55℃水浴3h；4）、加入等体积的饱和酚(pH8.0)，轻轻混合均匀，于4℃，12000rpm离心10-15min5）小心移取上清于新的灭菌EP管，后加入等体积的酚：氯仿：异戊醇（25：24：1），混匀，于4℃，12000rpm离心10-15min；6）小心移取上清于另一离心管，加入等体积氯仿：异戊醇（24：1），上下颠倒

5、混合均匀，于4℃，12000rpm离心10-15min；7）移取上清，加1/10体积的3MNaAC和二倍体积预冷的无水乙醇（-20℃），于-20℃冰箱中沉淀过夜或-80℃沉淀1h；8）4℃，10000rpm离心15min，弃上清；9）加入70%酒精，10000rpm离心10分钟，洗涤沉淀两次；10）将沉淀于室温放置，直至无酒精气味，加30-50μlTE缓冲液或RNase-free水溶解沉淀