叶绿体色素的提取

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1、叶绿体色素的提取、分离、定量及理化性质的鉴定【实验目的】1.掌握提取和分离叶绿体色素的方法；2.掌握测定叶绿体色素含量的方法；3.熟悉叶绿体色素的理化性质及吸光特性；4.了解植物叶绿体色素组成及其与生境的相关性。【实验原理】1.叶绿体色素是植物进行光合作用的重要物质，叶绿体色素包含绿色素（包括叶绿素a和叶绿素b）和黄色素（包括胡萝卜素和叶黄素）两大类，这两类色素都不溶于水，而溶于有机溶剂，故可用乙醇或丙酮等有机溶剂提取。提取液可用色层分析的原理加以分离。因吸附剂对不同物质的吸附力不同，当用适当的溶剂推动时，混合物中各成分在两相（流动相和固定相）间具有不同的分配系数，所以它们的移动速度不同，经过

2、一定时间层析后，便将混合色素分离。2.叶绿素是一种二羧酸——叶绿酸与甲醇和叶绿醇形成的复杂酯，故可与碱起皂化反应而生成醇（甲醇和叶绿醇）和叶绿酸的盐，产生的盐能溶于水中，可用此法将叶绿素与类胡萝卜素分开图一：叶绿素的结构3.叶绿素与类胡萝卜素都具有光学活性，叶绿素吸收光量子而转变成激发态，激发态的叶绿素分子很不稳定，当它变回到基态时可发射出红光量子，因而产生荧光。图二：叶绿素对光能的吸收与能量转变示意图1.叶绿素中的镁可以被H+所取代而成褐色的去镁叶绿素，后者遇铜则成为绿色的铜代叶绿素。铜代叶绿素很稳定，在光下不易破坏，故常用此法制作绿色多汁植物的浸渍标本。2.叶绿体色素具有吸光特性，可利用分

3、光光度计在某一特定波长下测定色素溶液光密度，即可用公式计算出其中各色素的含量。各种色素含量计算如下：Chla（μg/ml）=12.7OD663－2.69OD645Chlb（μg/ml）=22.9OD645－4.68OD663ChlT（μg/ml）=Chla+Chlb0.1ml提取液Chla含量（μg）=Chla（μg/ml）*0.1ml*稀释倍数0.1ml提取液Chlb含量（μg）=Chlb（μg/ml）*0.1ml*稀释倍数0.1ml提取液ChlT含量（μg）=ChlT（μg/ml）*0.1ml*稀释倍数（菠菜：稀释倍数=0.1ml/3ml=30，玉米：稀释倍数=0.3ml/3ml=10）每

4、种叶绿素含量计算（以Chla为例）：其中FW为样品总重（2.0g菠菜叶片，0.2g玉米叶片），V总=10ml3.叶绿体色素易受光氧化，提取色素应在弱光中进行，并避光保存色素。光照下叶绿体色素会被破坏。【实验材料】1.材料：菠菜叶片，玉米叶片2.试剂：9丙酮（100%及80%）；石英砂；碳酸钙粉；四氯化碳；醋酸铜；HCl（6N）乙醚，KOH-甲醇3.器材：研钵，培养皿，量筒，试管，滴管，定性滤纸，分光光度计，比色皿【实验内容】1.叶绿素的提取与定量（1）取菠菜新鲜叶片2g，玉米新鲜叶片0.2g。洗净，擦干，去掉中脉（玉米叶片可直接剪碎），剪碎，放入研钵中。（2）研钵中加入少量石英砂及碳酸钙粉，取

5、10ml丙酮，分几次加入研钵，充分研磨后过滤，定容至10,mL。（3）将两种植物的叶绿素提取液置于试管中，避光保存。备用。（4）取0.1ml菠菜叶片色素提取液及0.3ml玉米叶片色素提取液，用丙酮稀释到3ml，测定吸收光谱（400nm-700nm），测定663、645nm处的吸光值，根据公式计算叶绿素a、叶绿素b的含量。2.叶绿体色素的分离：取圆形定性滤纸一张，用毛细管吸取叶绿体色素提取滴在圆形滤纸中心，使色素扩散的宽度限制在0.5cm以内，保证叶绿素扩展速度均匀,保证色素扩展清晰,风干后，应多点样几次,大约20次左右.在圆形滤纸中心戳一圆形小孔（直径约3mm），将纸捻一端插入圆形滤纸的小孔中

6、，使与滤纸刚刚平齐（勿突出）。长形滤纸一条，也点样后层析分离（用于测定吸收光谱）培养皿中加入适量的四氯化碳，把带有纸捻的圆形滤纸平放在培养皿上，使纸捻下端浸入推动剂中。迅速盖好培养皿。此时，推动剂借毛细管引力顺纸捻扩散至圆形滤纸上，并把叶绿体色素向四周推动，不久即可看到各种色素的同心圆环。所用培养皿底、盖直径应相同，且应略小于滤纸直径，以便将滤纸架在培养皿边缘上。长形滤纸放入盛有四氯化碳大试管中，进行层析后获得线形不同色素条带，分别剪下后测定吸收光谱。叶绿素的理化性质部分3荧光现象的观察用反射光和透射光观察提取液的颜色有何不同，反射光下观察到的提取液颜色即为叶绿素产生的荧光颜色。4光对叶绿素的

7、破坏作用：取叶绿体色素提取液少许，分装两支试管中，一支放在黑暗处（或用黑纸套包裹），另一支放在强光下（阳光下），经过2-3h后，观察两支试管中溶液的颜色有何不同。5.铜代反应：取色素提取液少许于试管中，一滴一滴加浓盐酸，直至溶液颜色出现褐绿色，此时叶绿素分子已遭破坏，形成去镁叶绿素。然后加醋酸铜晶体少许，慢慢加热溶液，则又产生鲜亮的绿色。此即形成了铜代叶绿素。6.皂化反应：取叶绿体色素提取液2mL