植物叶绿体DNA的提取

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1、实验1植物叶绿体DNA的提取、PCR扩增与电泳观察【实验目的】1、学习从新鲜的绿色叶片中提取叶绿体DNA的方法2、学习和掌握琼脂糖凝胶电泳观察DNA的操作方法3、学习和掌握PCR实验的原理和操作方法【实验原理】叶绿体是绿色植物进行光合作用的细胞器，具有相对独立的遗传物质——叶绿体基因组DNA（ctDNA），大小在120～160kb，其DNA分子都是以共价、闭合、环状双链形式存在。由于cpDNA相对保守及其重要功能，已被广泛用于细胞质遗传、植物的系统发育、遗传多样性和亲缘关系等多方面的研究，而获得纯度高、产量好的、结构完整的ctDNA是开展相关研究的

2、前提条件。然而ctDNA的提取是限制深入研究的重要因素，传统的提取方法包括梯度离心提取ctDNA的方法，对设备要求高，成本高，耗时长．产率低。因此，我们要尽可能快速、简便地获得质纯、量大的ctDNA．一般来说获得纯度高、浓度大的叶绿体DNA很难，主要是因为叶绿体DNA含量太少同时在提取中有诸多因素干扰(如：核DNA、RNA、蛋白质等)。本实验通过改进部分传统操作，提取叶绿体基因组DNA，同时利用琼脂糖凝胶电泳及PCR实验检验提取效果。【实验仪器与试剂】1、器材：剪刀、烧杯、移液器、枪头、量筒、匀浆器、纱布、300目尼龙网、注射器、离心管、滤膜2、试

3、剂：①酶液：1%纤维素酶、0.6mM蔗糖、8mMCaCl2·2H2O、10mMNaH2PO4·2H2O，pH5.6②洗涤液：0.6mM蔗糖、8mMCaCl2·2H2O、2mMNaH2PO4·2H2O，pH5.6③10%SDS④溶液A：25mMEDTA，50mMTris，pH=8.0⑤Tris饱和酚，氯仿，异丙醇，TE，琼脂糖，goldview，Loadingbuffer，DNAmarker⑥新鲜叶片⑦PCRBuffer、Mg2+、dNTP、上、下游引物、ddH2O、TaqDNA聚合酶【实验步骤】一、叶片采集采集适量新鲜绿叶（约10g）二、细胞破碎首

4、先利用剪刀将叶片剪碎，然后放于匀浆器中，先加入不含酶的酶液进行匀浆，弃渣，将液体转移至烧杯中，加入纤维素酶至终浓度为1%后搅拌均匀，50度水浴约30分钟。一、叶绿体分离将经酶液处理的液体取出，依次用纱布和300目尼龙网与大注射器过滤，取滤液。1、用电组：将上述滤液转移至50mL离心管中，3000rpm离心3分钟，弃上清。用10mL洗涤液重悬洗涤后3000rpm离心3分钟，弃上清，洗涤两次后，即分离得到叶绿体。2、不用电组：利用大注射器及0.2μm滤膜过滤上述滤液后，将滤膜上的叶绿体刮下，转移至1.5mL离心管中，即分离得到叶绿体。二、DNA提取1、

5、用电组：①向叶绿体中加入500μL溶液A把叶绿体悬浮，转移至1.5mL离心管中。②加入200μL10%SDS（裂解叶绿体膜，释放DNA），混匀后静置2min；③加入350μL苯酚（使蛋白质变性）+350μL氯仿（与苯酚互溶，易于除去苯酚），混匀，10000rpm离心2min；④转移上层液体至新的离心管中，加入等体积氯仿（去除苯酚），混匀，10000rpm离心2min；⑤转移上层液体至新的离心管中，加入0.6倍体积异丙醇（沉淀DNA）沉淀10min；⑥10000rpm离心5min，弃上清；⑦加入500μL70%乙醇（去除盐离子）洗涤沉淀，10000r

6、pm离心5min，晾干；⑧30μLTE溶解DNA；1、不用电组：①向叶绿体中加入500μL溶液A把叶绿体悬浮；②加入200μL10%SDS，混匀后静置2min；③加入适量KI固体至饱和后静置至出现明显分层；④将下层透明液体转移至DNA吸附柱中，用洗耳球将液体吹出，DNA吸附于硅胶膜上，弃液体；⑤向吸附柱中加入500μL70%乙醇，用洗耳球吹出，弃液体，晾干；⑥将吸附柱至于新的1.5mL离心管中，用30μLTE溶解DNA，用洗耳球将液体吹入离心管中。三、PCR扩增特征条带25μL体系：PCRBuffer2.5μLMg2+1.5μLdNTP2.0μL上

7、、下游引物各2.5μL加至PCR管中ddH2O8.0μLTaqDNA聚合酶1.0μLDNA模板5.0μLPCR结束后，取5μL在O．8％的琼脂糖上电泳，观察。一、叶绿体DNA的电泳观察取提取的叶绿体DNA5μL在O．8％的琼脂糖上电泳，电泳1h后，使用自制的LED灯进行观察。【实验结果与讨论】1、为保证叶绿体DNA的含量和纯度，在本实验操作中，样品前处理、抽提、纯化等操作中应注意什么？2、提取不同种植物的叶绿体DNA，比较、分析实验结果。