植物的dna提取与鉴定

《植物的dna提取与鉴定》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。

1、栢物的DNA提取与鉴定.txt男人应该感谢20多岁陪在自己身边的女人。因为20岁是男人人生的最低谷，没钱，没事业；而20岁，却是女人一生中最灿烂的季节。只要锄头舞得好，哪有墙角挖不到？目的意义DNA是遗传信息的载体和基本遗传物质，它在遗传变杲、代谢调控等方而起着重耍作用，是分了生物学和基因工程研究的对象，但无论是研究植物DXA的结构和功能，还是开展外源DNA的转化、转导的研究，首先要做的就是从植物组织小提取天然状态的高分子量的纯化DNA。因此，本实验的冃的是学习植物基因组DNA提取方法、原理和DNA的鉴定技术。I植物基因纽DNA的提取（CTAB

2、法）一、原理栢物组织中绝大部分是核DNA,它和组蛋白、非组蛋白结合在一起，以核蛋白（即染色质或染色体）的形式存在丁细胞核内。CTAB（十六烷基三甲基決化hexadecyltrimethylammoniumbromide,简称CTAB）:是一种阳离了去污剂，可溶解细胞膜，它能与核酸形成复合物，在高盐溶液^（O.7mol/LNaCl）是可溶的，当降低溶液盐的浓度到一定程度（0.3mol/LNaCl）时从溶液中沉淀，通过离心就可将CTAB与核酸的复合物同蛋口、多糖类物质分开，然后将CTAB与核酸的复介物沉淀溶解于高盐溶液中，再加入乙醇使核酸沉淀，CT

3、AB能溶解于乙醇中。在DNA提取过程中必须始终注意以下几个关键问题：（1）DNA的二级结构和双链易受多种因素（如强酸、强碱、加热、低盐浓度、有机溶剂、酰胺类、尿素等）的影响引起双链解开，即“变性”，因此抽提时避免使用变性的条件。（2）抑制内外源DNase的活力。DNase就象一把刀，它能把人分了的DNA切成碎片，所以要加以杜绝，现可以通过多种途径来做到这一点：a、低温操作；b、调节pH,使偏碱（pH8.0）；c、抽提液中加表面活性剂;d、加螯合剂（EDTA）除去酶的铺助因子（Mg2+）,使酶活性丧失。（3）防止化学降解。如过酸或过碱以及其它化学

4、因素，会使DNA降解，-•般综合考虑，取pH&O左右为宜。（4）防止物理因素降解。如温度太高或机械张力剪切等，DNA分了特别人，其分了量可达1012道尔顿，极易被机械张力拉断，其至在细管中稍急一些的流动也会使DNA断裂，所以在抽提过程中耍特別注意这一点，操作过程要尽量简便、温和、减少搅拌次数，也不要剧烈摇动。（5）植物的次生代谢物（主要是胞质内的多酚类或色素类化合物）对核酸提取冇十扰作川。因此，一•般尽町能选幼嫩的、代谢旺盛的新牛组织作为提取DNA的材料，这是因幼嫩的新牛组织次生代谢物较少，DNA含量高，且易于破碎，植物材料最好是新鲜的。分离提

5、取植物DNA的方法很多，木实验采用CTAB法提取DNA并通过紫外吸收法和电泳鉴定。二、操作方法（1）取200mg样品（在液氮屮研磨成粉末状）放入1.5mL离心管中，加入600uLDNA提取液,颠倒混匀5-6次。65°C保温35分钟以上，其间颠倒混匀一次。（2）再加等体积的氯仿异戊醇（24：1）溶液轻轻摇晃30秒,在4°C下lOOOOrpm/分钟离心10分钟后，取吸上清液（450uL）（3）再加两倍体积的预冷界丙醇，混匀静止10分钟以上，在4°C下lOOOOrpm/分钟离心10分钟后，弃上清。（4）用600nL70%乙醇洗涤沉淀，重复一次，在室温

6、下倒置晾干。（5）沉淀用TE溶液溶解DNA,再加入RNase至终浓度50pg/mL,在37°C下保温半小时，将DNA样品放入冰箱保存。II植物DNA纯度的鉴定——紫外分光光度计法一、原理山于核酸中的碱基都貝有共轨双键，所以貝有紫外光吸收性质。核酸在紫外光谱区有一条典型的吸收曲线，其吸收高峰在260nni处，吸收低谷在230nni处。蛋白质在紫外区的吸收高峰在280nm处，所以核酸的紫外吸收光谱数据是鉴定核酸的重要依据之一。但紫外法不能区分DNA和RNA,只能用來鉴定核酸的纯度和含量。纯度鉴定时,需测定在230、260和280nm处的消光值,经验

7、数据表明,纯净的核酸溶液A260/A230的消光值比大于或等于2.0；A260/A280大于或等于1.80。A260/A280值过小，说明蛋口未脱净；A260/A230过小，说明有杂质(一般为多酚类或色索)。含量测定时，对于纯净的DNA来说，在实际应用屮可根据260nm处的消光值0.D260值换算成含量,一般认为0.D260值为1时,相当于50ug/mlo在测定核酸粗制品时,样品中残留的蛋白质和色素等与其它具紫外吸收的杂质对测定有明显干扰作用，大分子核酸制备过程中变性降解后有增色效应，因此有时此法测定的结果会高于定磷法。二、实验材料、仪器及试剂

8、1、材料植物DNA2、器材：紫外分光光度计、移液竹、试管3、试剂：TE溶液(pH8.0)(见前述)三、操作方法将纯化的DNA溶液用TE(pH&0)稀释