小麦黄花叶病毒P2蛋白原核表达、抗血清制备及其在感病小麦细胞中的定位.pdf

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1、浙江农业学报ActaAgriculturaeZhejiangensis，2014，26(3)：742-747http：／／www．zjnyxb．an杨狄，周燕茹，谢礼，等．小麦黄花叶病毒P2蛋白原核表达、抗血清制备及其在感病小麦细胞中的定位[J]．浙江农业学报，2014，26(3)：742—747．DOI：10．3969／j．issn．1004·1524．2014．03．34小麦黄花叶病毒P2蛋白原核表达、抗血清制备及其在感病小麦细胞中的定位杨狄，周燕茹，谢礼，孙丽英，陈剑平，(安徽农业大学生命科学学院，安

2、徽合肥230036；2浙江省农业科学院病毒学与生物技术研究所，浙江杭州310021)摘要：通过RT—PCR获得小麦黄花叶病毒(Wheatyellowmosaicvirus，WYMV)扬州分离物Jp2基因，并进行序列分析。P2基因编码区含有2635个核苷酸，编码一个由875个氨基酸组成的分子量72kDa的蛋白。在原核表达体系中，该基因的全长表达较困难，因此将P2基因的5端和3端各设计大约1kb亚克隆到原核表达载体pMAL—C2X中构建重组表达载体MBP—P2N，MBP—P2C，经IPTG诱导在大肠杆菌BL21

3、(DE3)中表达MBP—P2N和MBP—P2C融合蛋白。MBP—P2C融合蛋白经大量诱导、纯化、制备相应抗血清。用制备的抗血清可以有效检测WYMV病叶中的P2蛋白。免疫胶体金标记实验表明在感病wYMV的小麦叶片细胞膜状内含体结构中发现有大量胶体金颗粒特异性分布，表明P2蛋白可能与膜状内含体结构有关。关键词：小麦黄花叶病毒；基因；原核表达；抗血清制备；免疫胶体金标记中图分类号：S435．12文献标志码：A文章编号：1004—1524(2014)03-0742-06Subcellularimmuno-local

4、izationofP2proteinencodedbyWheatyellowmosaicvirusRNA2，usingpoly-cionalantibodyraisedagainstprokaryoticexpressed1>2fusionproteinYANGDi'，ZHOUYan．ru，XIELi，SUNLi—ying，CHENJian—ping，(CollegeofLifeSciences，AnhuiAgriculturalUniversity，Hefei230036，China；Instituteo

5、fVirologyandBiotechnology，ZhejiangAcademyofAgriculturalSciences，Hangzhou310021，China)Abstract：P2geneofWheatyellowmosaicvirus(WYMV)wasamplifiedbyRT—PCRfromWYMVinfectedwheatleaves．SequenceanalysisindicatedthatP2geneconstitutedof2635nts，encodingaproteinof875a

6、mino—acids(AA)withestimatedmolecularweightof72kDa．Duetoitslargeproteinmolecularweight，itisdificulttobeexpressedinprokaryoticexpressionsystem．Thus，5Lterminaland3·terminalpartsofP2gene(1kbeach)weresubclonedintotheprokaryoticexpressionvectorpMAL—C2X，respectiv

7、ely．Subsequently，theexpressedMBP—P2NandMBP—P2CfusionproteinwereinducedbyIPTGinEcoliBI21(DE3)．TheabundantlyinducedMBP—P2Cinfusionproteinthenwaspurified，andtherabbitantiserumagainsttothisproteinwasprepared．Experimentsindicatedthatthisantiserumcanbeusedtodete

8、cttheP2proteininWYMVinfectedwheatleavesbyWesternblottingandimmuno—goldlabeling．ItwasshownthatWYMVP2proteinwaslocatedinsubcellularmembranousbody．indicatingthatthisproteinmightbeassociatedwithmembrane—derivedin