小麦黄花叶病毒编码VPg蛋白结构及其亚细胞定位分析

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1、硕士学位论文指导教师姓名、职称陈剑壬瞳±申请学位级别亟±学科专业植物堂培养单位逝婆垣菹态堂量逝江笪壅些型堂随遁耋堂生生塑堇莶婴宜题论文提交时间2Q!兰生垒旦2旦论文答辩时间2Q!三生5目21旦学位授予单位与日期逝江!堕亟太堂答辩委员会主席型!塞修研究员论文评阅人2013年5月21日DissertationforMastercourseIIIIIIIIlUUllIIIIlY2413734STRUCTURALANDSUBCELLULARDISTRIBUTION0FVPGPROTEINENCODEDBYⅥ僵狂!ATYELLO

2、WMOSAICCandidate：BianJingVⅡ乇USSupervisor：ProfessorChenJianpingDiscipline：BotanyCollegeofChemistry&LifeScience，ZhejiangNormalUniversity,Jinhua321004May2013本研究得到农业部小麦产业体系病毒病防控(CARS．3．1．14)及农业部转基因小麦新品种培育子课题(2011ZX8002．001)项目和“现代农业生物技术与作物病害防控”——浙江省高校重中之重学科建设资金资助研究工作

3、在浙江省农业科学院“浙江省植物有害生物防控重点实验室——省部共建国家重点实验室培育基地”完成ThisworkwasfinanciallysupportedbytheProjectofScientificandTechnicalSupportSystemforWheatProduction(CARS⋯314)fromChineseMinistryofAgricultureandtheProjectofNewVarietiesGeneticallyModifiedWheatofChina(201ZX08002-001)an

4、dtheProgramofKeySubjectConstructionforModemAgriculturalBiotechnologyandCropDiseaseControlinZhejiangUniversity．ThisworkwasdoneintheStateKeyLaboratoryBreedingBaseforZhejiangSustainablePestandDiseaseContr01．小麦黄花叶病毒编码VPg蛋白结构及其亚细胞定位分析摘要小麦黄花叶病是我国冬小麦的重要病毒病，该病由小麦黄花叶病毒(W

5、heatyellowmosaicvirus，WYMV)引起，通过禾谷多黏菌(PolymyxagraminisL．)传播。WYMV属于马铃薯Y病毒科大麦黄花叶病毒属成员，其基因组是由两条正义单链RNA组成，RNAl编码8个蛋白，分别是P3、7K、CI、14K、NIa-VPg、NIa．Pro、NIb、CP；RNA2编码2个蛋白P1和P2。本研究主要围绕RNAl编码的病毒末端结合蛋白(VPg)展开的。VPg蛋白是一种多功能蛋白，参与病毒的复制、翻译、运动等基本生命活动。我们采用现代生物信息学方法分析WⅥⅥVVPg蛋白特点，发

6、现它具有核定位信号与核输出信号功能。利用细胞组分分级分离法、免疫电镜胶体金标记法以及荧光定位法观察到VPg蛋白在真核细胞中单独表达时定位于细胞核中，并以两种形态存在，一种是在核内凝集成一个或几个形状不规则的包涵体；另一种是均匀分布于整个细胞核中，而在WYMV侵染的小麦叶片细胞中，发现在有其他WYMV编码蛋白存在的情况下，VPg在细胞质和细胞核内均有分布。我们根据NLS和NES设计VPg一系列突变体，通过激光显微镜观察它们与GFP融合蛋白在烟草细胞中的表达情况发现，WYMVVPg中N端第1．22位氨基酸以及NLS序列是其

7、能否定位于细胞核的关键决定域。为了进一步研究VPg蛋白与寄主蛋白或病毒编码蛋白的互作情况，我们将GST标签载体和GST．VPg融合蛋白进行了大量表达并纯化，以它们作为诱饵对感染WYMV的小麦叶片总蛋白进行PULL．DOWN实验，结果捕获了6个小麦来源的蛋白和2个WYMV来源的蛋白(CP和Ma)；再利用免疫共沉淀和双分子荧光互补实摘要验验证，结果显示VPg蛋白与CP蛋白发生结合，并且结合部位在VPg蛋白C端第96．187位氨基酸序列，这段序列是它与CP蛋白互作所必须的。当CP与VPg互作的同时，CP蛋白协助VPg从细胞核

8、内转运到细胞质中，它是VPg进行核质穿梭所需的外在因素，同时NES序列是VPg在细胞中进行转运、完成核质穿梭所必需的内在因素。另外，在研究中我们运用相同的实验方法检测WYMVVPg与病毒粒子的结合情况，我们对提纯的wYMV病毒粒子利用特异抗血清检测到VPg蛋白的存在，说明VPg蛋白可直接结合在病毒粒子上；再利用免疫胶体金标记法验证