母猪饲粮中添加精氨酸对仔猪肠道免疫细胞数量的影响.pdf

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动物营养学报2014，26(8)：2077．2084ChineseJournalofAnimalNutritiondoi：10．3969／j．issn．1006—267x．2014．08．008母猪饲粮中添加精氨酸对仔猪肠道免疫细胞数量的影响寇涛吕佳琪李伟王恬(南京农业大学动物科技学院，南京210095)摘要：本试验旨在研究母猪饲粮中添加精氨酸(Arg)对子宫内发育迟缓(IUGR)仔猪肠道免疫细胞数量的影响。试验选择20头妊娠30d的母猪(长白X大白)，随机分为2组(每组10头)，分别饲喂基础饲粮和添加1％Arg的基础饲粮至母猪生产。从饲喂基础饲粮的母猪所产的仔猪中选8头正常初生重母猪和8头IUGR母猪，分别为对照组和IUGR组；从饲喂添加1％Arg的基础饲粮的母猪所产仔猪中选择8头IUGR母猪，为Arg+IUGR组，各组仔猪随母猪哺乳。于仔猪7和21日龄，每组随机选取4头仔猪屠宰，检测空肠及回肠黏膜免疫细胞数量。结果表明：Arg+IUGR组仔猪8～21日龄及1～21日龄平均日增重高于IUGR组(P>0．05)；IUGR组仔猪7日龄小肠杯状细胞数量和21日龄回肠杯状细胞数量均显著低于对照组(P<0．05)，Arg+IUGR组仔猪7日龄空肠肥大细胞和回肠杯状细胞数量极显著高于IuGR组(P<0．01)，回肠肥大细胞和空肠杯状细胞数量也有所提高(P>0．05)；Arg+IUGR组仔猪21日龄空肠肥大细胞和杯状细胞数量及回肠杯状细胞数量均显著高于IUGR组(P<0．05)。综上所述，母猪饲粮中添加Arg可提高IUGR仔猪平均日增重，增加后代IUGR仔猪肠道免疫细胞数量，增强仔猪肠道免疫力。关键词：精氨酸；IUGR仔猪；母体效应；小肠；肥大细胞；杯状细胞中图分类号：$828文献标识码：A文章编号：1006—267X(2014)08—2077—08仔猪初生重是后天生长发育的一项重要指所必需的一种氨基酸j。而猪胚胎在官内发育标，宫内发育迟缓(intrauterinegrowthretardation，过程中处于Arg营养缺乏状态。Wu等的研究IUGR)可多方面影响出生后的生长发育。肠道是发现，精氨酸氮在羊水、尿囊液中占总氮的比例很动物消化吸收的主要场所，也是体内最大的免疫高，这提示Arg代谢在宫内营养中占有重要地位。器官，因此增强仔猪肠道免疫功能是提高机体抗有报道称Arg强化的肠内营养可增加肠黏膜厚度病力、促进仔猪健康发育的重要手段。研究发现，及小肠绒毛数量，降低肠黏膜的通透性，减少肠道饲粮中添加酶制剂、酸化剂、中草药、寡糖和谷氨细菌易位的机会。但目前有关于Arg的母体效酰胺等营养物质可改善仔猪肠道环境，增强机体应对IUGR仔猪空肠及回肠内免疫细胞数量的研免疫功能J。精氨酸(Arg)具有重要的生理代究报道不多，因此，本试验通过在妊娠母猪饲粮中谢和营养作用，在促进肌肉蛋白质合成、增强机体添加l％Arg测定其后代中IUGR仔猪的生长性的免疫力和细胞分裂等生理过程中具有重要的作能、小肠中免疫细胞的数量来研究Arg的母体效用，并且Arg是幼龄哺乳动物达到最大生长性能应对IUGR仔猪肠道的调控作用，为该方面的研究收稿日期：2014—03—06基金项目：江苏高校优势学科发展计划项目作者简介：寇涛(199l一)，男，甘肃庆阳人，硕士研究生，动物营养与饲料科学专业。E-mail：koutao91526@163．com通讯作者：王恬，教授，博士生导师，E—mail：twangl8@163．com 动物营养学报提供理论依据。各选取4头仔猪进行屠宰。屠宰前12h停食，随后颈动脉放血致死，迅速打开腹腔，取出肠道，用1材料与方法磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗，从小肠中分离出空肠1．1试验动物、饲养管理及分组和回肠。在各段肠道1／2处取1．5cm的肠段并用本试验选取妊娠母猪(长白×大白，试验开始4％的多聚甲醛进行固定。于妊娠30d)20头，随机分2组饲养，分别为基础1．3肠道组织形态学观察饲粮组和基础饲粮添加l％Arg组，每组l0头母1．3．1制作石蜡切片猪，母猪单栏饲养，自由采食。待母猪产后，从基组织样用多聚甲醛固定24h后，制作石蜡切础饲粮组母猪所生产仔猪中选8头正常初生重母片。组织切片程序为：取材固定8～l2h一修样一猪和8头IUGR母猪，分别为对照组和IUGR组，洗涤一70％酒精脱水45～60min--,85％酒精脱水从基础饲粮添加1％Arg组母猪所生产仔猪中选845～60min---~95％酒精脱水45～60min~100％酒头IUGR母猪，为Arg+IUGR组，共3组，每组4个精脱水2次一透明(二甲苯15～20min)2次一透重复，每个重复2头仔猪，各组仔猪随母猪哺乳至蜡3次，各40min一包埋一切片一贴片一烤片。屠宰。IUGR仔猪选择标准为初生重低于平均值1．3．2石蜡切片染色的2个标准差。母猪基础饲粮组成及营养水见1．3．2．1阿利新兰一高碘酸雪夫氏(AB—PAS)染色表l。染色程序为：切片脱蜡至水一人0．5％～1．0％表1母猪基础饲粮组成及营养水平(风干基础)高碘酸水溶液氧化5min一蒸馏水速洗1次一Table1CompositionandnutrientlevelsofSchif氏液染色30～6Omin经Schif氏液后，以thebasaldietforSOWS(air—drybasis)％亚硫酸水洗2～3次，每次约30S至1min一蒸馏水项目Items含量Content速洗2次一苏木精复染核一苏木精复染色后，经组成IngredientsO．5％盐酸酒精溶液分色(5～10S)，以镜检为准，玉米Com62．O0用自来水蓝化一经95％酒精及其无水酒精脱水，豆粕Soybeanmeal18．0O各l～2min一二甲苯透明一中性树胶封固。AB．麸皮Bran12．00PAS染色主要用于观察杯状细胞。醋糟Vinegarlees4．00预混料Premix4．OO1．3．2．2甲苯胺蓝染色合计Total100．00染色程序为：切片脱腊至水一蒸馏水浸洗3营养水平Nutrientlevels次一切片从水中取出，甲苯胺蓝液浸染3Os一蒸馏消化能DE／(MJ／kg)13．22水浸洗(洗净甲苯胺蓝染液为止)一95％酒精分粗蛋白质CPl5．20色，在镜下观察控制一100％酒精脱水一二甲苯透赖氨酸Lys0．69明一中性树胶封固。甲苯胺蓝染色主要用于观察蛋氨酸Met0．5l苏氨酸Thr0．54肥大细胞。色氨酸TrpO．171．3．3肠道免疫细胞的观察与计数预混料为每kg饲粮提供Thepremixprovidedthefol—在NikonECLIPSE一80i和OlympusBX一51显lowingperkgofthediet：VA8800IU，VD1600IU，VE微镜光镜下分别详细观察和检测每组的空肠和回40mg，VBl0．4mg，VB23．6mg，VB61mg，烟酸niacin肠黏膜上皮肥大细胞和杯状细胞数量和分布。具16mg，泛酸pantothenicacidl1mg，氯化胆碱cholinechlo—体检测方法是：1)统计观察每根肠管横断面的肠ride180mg，Cu(CuSO4)96mg，Fe(FeSO4)88mg，Zn壁全层，包括黏膜及黏膜下层、肌层及浆膜层的肥(ZnSO4)76mg，Mn(MnSO4)24mg，Co(CoC12)0．4mg，I大细胞数量和分布；2)取每根肠管横断面，统计观(CalO；)0．4mg。察5根最长且排列整齐的绒毛，计数每100个肠黏消化能为计算值，其余为实测值。DEwasacalculat—膜上皮柱状细胞问内杯状细胞的数量和分布。edvalue，whiletheothersweremeasuredvalues．1．4数据统计1．2样品采集试验结果用平均值±标准误表示，采用SPSS仔猪在屠宰前(7及21目龄)进行称重，每组16．0软件进行组问方差分析和多重比较。以P< 8期寇涛等：母猪饲粮中添加精氨酸对仔猪肠道免疫细胞数量的影响0．05作为差异显著的判断标准，以PO．05)；IUGR组和Arg+IUGR组仔猪l～7日龄平均日增2结果与分析重均显著低于对照组(P<0．05)；各组仔猪8—2l2．1母猪饲粮中添加Arg对仔猪平均日增重的Et龄及l一21日龄平均日增重均差异不显著(P>影响0．05)，且Arg+IUGR组仔猪平均Et增重高于Iu—在整个试验期间各组均无仔猪死亡。由表2GR组，分别比IUGR组提高14．29％和10．53％，但可知，Arg+IUGR组仔猪初生重极显著低于对照组差异不显著(P>0．05)。表2母猪饲粮中添加Arg对仔猪平均日增重的影响Table2EffectsofSOWdietsupplementedwithArgonaveragedailygainofpiglets同行数据肩标不同小写字母表示差异显著(P<0．05)，不同大写字母表示差异极显著(P<0．01)，相同字母或无字母表示差异不显著(P>0．05)。下表同。Inthesamerow，valueswithdifferentsmalllettersuperscriptsmeansignificantdifference(P<0．05)，andwithdifferentcap-itallettersuperscriptsmeansignificantdifference(P<0．01)，whilewiththesameornolettersuperscriptsmeannosignificantdifference(P>0．05)．Thesameasbelow．2．2母猪饲粮中添加Arg对肠道黏膜免疫细胞的组(P>0．05)。影响对于21日龄仔猪，Arg+IUGR组空肠肥大细2．2．1小肠黏膜上皮肥大细胞的数量分布变化胞数量较对照组和IUGR组分别提高45．09％和由表3可知，对于7日龄仔猪，Arg+IUGR组50．46％，差异显著(P<0．05)，但对照组和IUGR空肠肥大细胞数量极显著高于对照组和IUGR组组之间差异不显著(P>0．05)；回肠肥大细胞数量(P<0．01)，分别提高94．29％和140．40％；各组回各组间差异不显著(P>0．05)，但Arg+IUGR组的肠肥大细胞数量差异不显著(P>0．05)，Arg+IUGR细胞数量比对照组和IUGR组有所提高。组较IUGR组肥大细胞数量有所提高，但低于对照表3仔猪小肠黏膜上皮肥大细胞数量Table3Thenumberofintestinalmucosaepithelialmastcellsofpiglets个／1000Ixm“个／1000m。”表示每1000m肠绒毛表面积上肥大细胞的个数。“cell／1000m。”indicatedthenumberofmastcellsinsurfaceareaofintestinalvillusper1000m。 动物营养学报26卷3．2母猪饲粮中添加Arg对仔猪肠道免疫细胞岛素的水平，胰岛素与受体结合后，导致胞内胰岛数量的影响素受体底物的多个酪氨酸残基发生磷酸化，激活肠道的屏障功能主要由肠黏膜屏障来实现磷脂酰肌醇3一激酶(PI3K)和蛋白激酶B(Akt)信的，包括机械屏障、生物屏障、化学屏障、免疫学屏号，Akt又促进了下游分子哺乳动物雷帕霉素靶蛋障和肠黏膜固有层筛等部分。Gaskins|1报道，白(mTOR)的磷酸化，从而调节蛋白合成、细胞迁肠上皮细胞是仔猪抵抗饲料毒素及外来致病菌的移和肠道复原，在细胞蛋白合成和生长中发挥重第一道防线，其表面含有毒素及细菌受体，且包含要作用。此外，在肠道上皮细胞中，PI3K可具有一定免疫功能的淋巴细胞和杯状细胞。Zie—促进肠道黏膜细胞的增殖，Arg对PI3K信号的激gler等发现仔猪断奶前肠道的发育主要依赖细活，可能促进了肠上皮免疫细胞的增殖。这可胞的增殖。而IUGR会导致肠道上皮细胞凋亡增能使得Arg抑制了肠道表皮中肥大细胞和杯状细多，造成肠道生长和形态发生改变。由于Arg及胞的凋亡，促进了细胞的增殖，从而提高了IUGR仔猪肠道的免疫功能。其代谢产物如一氧化氮，在免疫防御和调节、肠道IUGR仔猪的小肠组织生长在出生后l周内黏膜功能的保护以及肿瘤特异性免疫等方面发挥能部分实现补偿，而且补偿生长的实现是随着日着重要作用，因此可将Arg添加到饲粮中以提高龄增加逐步完全的j。本试验Arg+IUGR组仔猪动物的免疫功能。的初生重极显著低于对照组和IUGR组，但Arg+肥大细胞是抗感染免疫的第一线细胞，能通IUGR组仔猪7及21日龄体重增至与IUGR组仔过所分泌的细胞因子参与获得性免疫，是重要的猪差异不显著。这提示Arg对于IUGR的生长补免疫活性细胞¨埘。杯状细胞可通过特异性免疫偿有促进作用。而Arg+IUGR组仔猪肠道各项指机制和非特异性免疫机制参与并调节肠道局部免标均高于对照组或与对照组相当，这说明Arg的疫机能，它能分泌一种酸性物质到达黏膜表面，从母体效应在仔猪妊娠期间对于IUGR仔猪肠道免而形成一层保护膜而发挥屏障作用。因此，肥疫细胞的增殖显示出很好的补偿作用，但是Arg大细胞和杯状细胞在IUGR仔猪肠道免疫机能的的作用没有明显提高IUGR仔猪初生重和7和21调节中起重要作用。本试验结果发现Arg的母体日龄的体重至正常仔猪水平，这可能是由于Arg效应主要影响空肠肥大细胞的数量，可显著提高的补偿生长作用仅恢复了IUGR仔猪肠道免疫细IUGR仔猪的空肠肥大细胞数量，并且细胞数量显胞的数量和肠道的正常功能，而Arg对肠道免疫著高于对照组。这说明提高妊娠母猪饲粮中的功能促进作用却不足以弥补IUGR仔猪初生重低Arg水平可以显著提高肠道中肥大细胞的数量，从的不足，才使得IUGR仔猪的体重没有明显提高。而改善IUGR仔猪的肠道免疫功能。本试验还发此外，Muaku等研究发现，外源促生长因子能促现与IUGR组相比，Arg+IUGR组仔猪7日龄回进IUGR幼鼠在生后23d完全实现补偿生长。本肠、21日龄空肠及回肠中杯状细胞数量显著提高，试验Arg的母体效应并未实现完全补偿生长，这而7日龄空肠杯状细胞数量与IUGR组相比无显可能是由于试验期太短，Arg的补偿作用还未完全著差异，但有所提高，这可能是由于初生和哺乳阶实现段IUGR仔猪肠道内极低的精氨酸酶活性使仔猪肠细胞对Arg的代谢能力有限所致‘’。Arg+IU—4结论GR组空肠和回肠杯状细胞数量与对照组差异均在妊娠母猪饲粮中添加l％的Arg可促进哺不显著，这说明Arg的母体效应确实能提高[UGR乳期低初生重IUGR仔猪的补偿生长，并提高Iu—仔猪小肠中杯状细胞数量到正常仔猪水平。本试GR仔猪的平均日增重至正常仔猪水平。Arg的母验Arg的母体效应能提高IUGR仔猪小肠的免疫体效应能显著地提高7及21日龄IUGR仔猪小肠细胞数量的机制与Arg的多种营养生理特性有黏膜上皮肥大细胞和杯状细胞的数量，提高IUGR关。Sukhotnik等研究发现补充Arg能提高小仔猪的免疫功能，改善肠道免疫机能。肠黏膜厚度，提高黏膜DNA含量和蛋白质含量，促进大鼠小肠细胞的增殖和受损黏膜的修复。参考文献：Arg的母体效应可能提高了IUGR小肠黏膜中胰[1]KONGXF，wuGY，LIAOYP，eta1．Dietarysup— 8期寇涛等：母猪饲粮中添加精氨酸对仔猪肠道免疫细胞数量的影响2083plementationwithChineseherbalultrafinepowder杂志，2004(2)：155—157．enhancescellularandhumoralimmunityinearly—[16]GASKINSHR．Theintestinalimmunesystem：gutre—weanedpiglets[J]．LivestockScience，2007，108(1／action(orlackthereof)andgrowthofthepig[J]．2／3)：94-98．JournalofAnimalScience，1996，74(Supp1．1)：169．[2]冷向军，王康宁，杨凤，等．酸化剂对早期断奶仔猪胃[17]Z1EGLERTR，ESTIVARIZCF，JONASCR，eta1．酸分泌、消化酶活性和肠道微生物的影响[J]．动物Interactionsbetweennutrientsandpeptidegrowthfac—营养学报，2002，14(4)：44—48．torsinintestinalgrowth，repair，andfunction[J]．Jour—[3]周锡红，朱燕午，吴信．仔猪精氨酸营养及精氨酸生素nalofParenteralandEnteralNutrition，1999，23(Sup—在仔猪中的应用进展[J]．饲料博览，2010(3)：6—8．p1．6)：S174-$183．[4]FLYNNNE，MEININGERCJ，HAYNESTE，eta1．[18]郝振荣，朱志宁，王明，等．大豆异黄酮对奶牛泌乳后期Themetabolicbasisofargininenutritionandpharma—泌乳性能、免疫功能和乳腺肥大细胞白介素～4水平cotherapy[J]．Biomedicine&Pharmacotherapy，2002，的影响[J]．动物营养学报，2010，22(6)：1679—1686．56(9)：427—438．[19]唐秀莹，陈正礼，罗启慧，等．大豆异黄酮对大鼠肠道[5]WUG，OTTTL，KNABEDA，eta1．Aminoacid上皮内淋巴细胞、杯状细胞及瘦素长型受体的影响compositionofthefetalpig[J]．TheJournalofNutri—[J]．浙江大学学报：农业与生命科学版，2013，39tion，1999，129(5)：1031—1038．(3)：343-350．[6]ADJEIAA，YAMAUCHIK，NAKASONEY，eta1．[20]吴琛，刘俊锋，孔祥峰，等．仔猪内源性精氨酸合成研Arginine-supplementeddietsinhibitendotoxin—induced究进展[J]．动物营养学报，2011，23(1)：5-9．bacterialtranslocationinmice[J]．Nutrition，1995，11[21]SUKHOTNIKI，MOGILNERJ，KRAUSZMM，et(4)：371—374．a1．Oralargininereducesgutmucosalinjurycausedby[7]RAFIEEM，BARAM，STEPHENSC，eta1．Applica—lipopolysaccharideendotoxemiainrat[J]．JournaloftionofERICPCRforthecomparisonofisolatesofSurgicalResearch，2004，122(2)：256—262．Haemophilusparasuis[J]．AustralianVeterinaryJour—[22]INOKIK，LIY，ZHUT，eta1．TSC2isphosphorylatednal，2000，78(12)：846-849．andinhibitedbyAktandsuppressesmTORsignalling[8]蔡旭旺，刘正飞，陈焕春，等．副猪嗜血杆菌的分离培[J]．NatureCellBiology，2002，4(9)：648—657．养和血清型鉴定[J]．华中农业大学学报，2005，24[23]MARANDIS，DEKEYSERN，SALIEZA，eta1．Insu—(1)：55—58．linsignaltransductioninratsmallintestine：roleof[9]罗彬，黄兴国．精氨酸的营养功能及在仔猪生产中的MAPkinasesinexpressionofmucosalhydrolases[J]．应用[J]．湖南饲料，2008(3)：24—26．AmericanJournalofPhysiology—Gastrointestinaland[10]刘星达，彭瑛，吴信，等．精氨酸和精氨酸生素对母猪LiverPhysiology，2001，280(2)：G229一G240．泌乳性能及哺乳仔猪生长性能的影响[J]．饲料工[24]SARBASSOVDD，GUERTINDA，AUSM，cta1．业，2011，32(8)：14—16．PhosphorylationandregulationofAkt／PKBbythe[11]MATEORD，WUG，BAZERFW，eta1．Dietaryrictor—mTORcomplex[J]．Science，2005，307L—argininesupplementationenhancesthereproductive(5712)：1098—1101．performanceofgilts[J]．TheJournalofNutrition，[25]SHENGH，SHAOJ，TOWNSENDCM，eta1．Phos—2007，137(3)：652-656．phatidylinositol3-kinasemediatesproliferativesignals[12]王垮．精氨酸对仔猪宫内发育及N一氨甲酰谷氨酸inintestinalepithelialcells[J]．Gut，2003，52(10)：对断奶仔猪生长的影响[D]，博士学位论文．南昌：l472～1478。江西农业大学，2012：36—38．[26]周根来，王恬，霍永久，等．胎儿宫内发育迟缓对新生[13]JOBGENWS，FRIEDSK，FUWJ，eta1．Regulatory仔猪小肠组织发育的影响[J]．动物营养学报，roleforthearginine-nitricoxidepathwayinmetabo-2006，18(1)：19-25．lismofenergysubstrates[J]．TheJournalofNutrition—[27]MUAKUSM，THISSENJP，GERARDG，eta1．Post-alBiochemistry，2006，17(9)：571—588．natalcatch—upgrowthinducedbygrowthhormoneand[14]卢岩，刘晓梅，李书琴．L一精氨酸对宫内发育迟缓胎insulin—likegrowthfactor—Iinratswithintrauterine鼠胰岛素样生长因子及其结合蛋白表达的影响growthretardationcausedbymaternalproteinmalnu—[J]．中国当代儿科杂志，2006，8(4)：319—322．tritionl[J]．PediatricResearch，1997，42(3)：370—[15]徐辉，粟永萍．黏膜免疫调节的研究进展[J]．免疫学377． 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