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时间:2020-05-23
《雷帕霉素对人角质形成细胞系HaCaT细胞自噬诱导效应及其分子机制的初步研究.pdf》由会员上传分享,免费在线阅读,更多相关内容在应用文档-天天文库。
1、2014年43卷第5期JClinDermatol,May2014。Vo1.43。No.5267论著雷帕霉素对人角质形成细胞系HaCaT细胞自噬诱导效应及其分子机制的初步研究陈旭,徐松,黄丹,鞠梅,陈凫,李新宇,顾恒(中国医学科学院、北京协和医学院皮肤病研究所,江苏省皮肤病与性病分子生物学重点实验室,江苏南京210042)[摘要]目的:初步探讨雷帕霉素在不同浓度和不同孵育时间下,对人角质形成细胞系HacaT细胞自噬的诱导效应及其分子机制。方法:不同浓度雷帕霉素处理HaCaT细胞4h或12h后,利用四甲基偶
2、氮唑盐(MTr)方法检测雷帕霉素对细胞活力的影响,并提取蛋白进行蛋白印迹实验,检测LC3一Ⅱ表达水平,作为自噬的检测方法;通过透射电镜分析自噬体形成,确认雷帕霉素对自噬的诱导效果。检测自噬调控上游关键元件哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(roTOR)蛋白表达及其ser248和ser244s磷酸化产物水平,分析mTOR活性;并分析自噬调控下游的另~关键基因Atg7的表达,初步分析雷帕霉素诱导HacaT细胞的分子机制。结果:不同浓度雷帕霉素处理4h,对HaCaT细胞的活力没有显著的影响。高剂量雷帕霉素(80nmoI/
3、L和100nmol/L)在处理12h后对HaCaT细胞的活力产生毒性效应。20nmol/L和50nmol/L雷帕霉素孵育4h诱导HaCaT细胞LC3一H表达上调.而20nmol/L和50nmol/L雷帕霉素孵育12h仍具有诱导效应。相较于其他浓度,在50nmol/L雷帕霉素孵育诱导的LC3一Ⅱ表达上调效应最为显著,并且在药物孵育4h时超微结构水平诱导产生胞质内大量自噬体形成。150nmol/L浓度的雷帕霉素孵育4h或12h均可诱导HaCaT细胞roTORse-和mT0Rsep磷酸化产物水平降低;然而At
4、表达不能观测到显著的差异。结论:50nmol/L雷帕霉素孵育4h具有显著的诱导HaCaT细胞自噬效应。HaCaT细胞mTOR分子对雷帕霉素处理敏感,可被其诱导产生蛋白活化抑制效应。这种mT0R信号抑制可能参与了雷帕霉素对HacaT细胞的自噬诱导效应,但Atg7没有参与这种调控效应。[关键词】雷帕霉素;角质形成细胞;自噬【中图分类号】R751[文献标识码]A【文章编号11000—49636(2014)05—0267—05Researchonrapamycin-inducedautophagyanditsm
5、echanismsinHaCaTcellsCHENXu,XUSong,HUANGDan,JUMei,CHENKun,LIXin-yu,GUHeng(InstituteofDermatology,ChineseAcademyofMedicalSciences&PekingUnionCollege,Nanjing210042,China)[Abstract】0bjectives:I11eaimsofthisstudyweretoinvestigatetheeffectsofrapamycinonautoph
6、agyinhumankeatinocytecellline,HaCaTcells,anditsmolecularmechanisms.Methods:HaCaTcellsweretreatedwithdiferentconcen~ationsofrapamycinfor4or12hours.MTrassaywasusedtodetectthecellviability.Totalproteinfromcelllysiswassubjectedtowestern-blottingtodetermineth
7、eexpressionlevelsofLC3一Ⅱ.amarkerofautophagyprocess.Transmissionelectronmicroscopywasusedtoevaluatetheformationofautophagosomesandtovalidatetheinductionofautphagy.TheexpressionlevelsofphosphorylatedmTORatser2448andser2481sites,theup-streamofautophagyproce
8、ss,wereanalyzedtodeterminetheactivationofmTORInaddition,Atg7,akeyregulatorygeneofdown-steamforautophagyprocess,wasexamined.ThesepreliminaryresultswereusedtodeterminethepotentialmechanismswherebyrapamycininducesautophagyinH
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