雷帕霉素对白血病细胞株抗肿瘤效应及其机制的初步研究

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1、（《中国图书资料分类法》分类号）单位代码：10660R733.7学号：S090066贵阳医学院2012届硕士学位论文雷帕霉素对白血病细胞株抗肿瘤效应及其机制的初步研究研究生：陈涛导师：张亚莉副教授曾小菁教授年级：2009级专业：临床检验诊断学2012年5月23日目录摘要……………………………………1前言……………………………………3材料与方法………………………………5结果……………………………………12讨论……………………………………28参考文献…………………………………33英文摘要…………………………………37略缩词表…………………………

2、………39论文原创性声明…………………………40附：综述………………………………41贵阳医学院2012届硕士研究生论文雷帕霉素对白血病细胞株抗肿瘤效应及其机制的初步研究临床检验诊断学研究生：陈涛导师：张亚莉副教授曾小菁教授摘要【目的】探讨雷帕霉素对白血病细胞株的生物学影响及其在诱导肿瘤细胞凋亡及自噬、抑制肿瘤血管生成等方面存在的可能的抗肿瘤机制。【方法】常规方法复苏、传代培养HL-60（人急性早幼粒细胞性白血病细胞株）、K562（人慢性粒细胞性白血病细胞株）、SUP-B15（人急性B淋巴细胞性白血病细胞株）细胞，取对数期细胞以不同浓度雷帕霉

3、素（0.1～100nmol/L）处理72h后，采用MTT法测定雷帕霉素对白血病细胞株增殖的抑制作用，筛选对雷帕霉素作用敏感的白血病细胞株；雷帕霉素敏感细胞株设置空白对照组（正常培养）、雷帕霉素处理组（10、20、50、100nmol/L）处理24h、48h、72h后收集细胞用于检测：①倒置相差显微镜观察细胞生长状况，常规瑞氏染色后光学显微镜下观察细胞形态；MTT比色法检测不同处理组细胞的活力和增殖能力的改变；②采用AnnexinV-FITC/PI双染流式细胞术检测细胞凋亡；③采用实时荧光定量PCR方法检测Bcl-2、Beclin1、HIF-

4、1α、VEGF基因表达变化；④吖啶橙单染荧光显微镜观察细胞自噬；⑤透射电镜观察亚细胞结构变化。【结果】1.MTT实验结果显示，雷帕霉素对HL-60、K562、SUP-B15细胞IC50值分别为156.894nmol/L、157.549nmol/L、18.174nmol/L，相对于HL-60、K562细胞，雷帕霉素对SUP-B15细胞的抑制作用较强，且该抑制作用随药物剂量增加和作用时间延长而增强；2.倒置显微镜观察发现，不同浓度雷帕霉素处理后，SUP-B15细胞活细胞数量减少，死细胞数量增加，细胞出现抱团生长、胞膜出泡、细胞破碎等现象，并随雷

5、帕霉素浓度升高和作用时间延长，变化程度更加明显。观察瑞氏染色的各组细胞，与空白对照组比较，不同浓度雷帕霉素作用SUP-B15细胞72h后，细胞胞浆出现空泡，并随雷帕霉素浓度升高而增多；3.流式细胞仪检测细胞凋亡结果显示，不同浓度雷帕霉素作用于SUP-B15细胞可引起细胞凋亡增加，48h、72h细胞凋亡率较24h时高；雷帕霉素作用48h时的细胞凋亡率随药物浓度增大而增多，而72h时较高剂量药物（50nmol/L、100nmol/L）引起的细胞凋亡较低剂量药物（10nmol/L、20nmol/L）少；4.吖啶橙单染荧光显微镜观察细胞自噬结果显示

6、，与空白对照组相比，不同浓度雷帕霉素处理SUP-B15细胞24h后，可见胞浆中红色斑点的酸性膜泡（即为自噬小体）增多，且红色斑点数量随药物浓度增大和1贵阳医学院2012届硕士研究生论文作用时间延长而增多；5.透射电镜观察结果显示，经雷帕霉素处理的SUP-B15细胞胞浆内可见较多自噬小体和自噬溶酶体，线粒体内嵴明显紊乱，细胞核不规则；6.与各时间段对照组相比，不同浓度雷帕霉素处理SUP-B15细胞24h、48h、72h后，均可上调Bcl-2基因的表达（P<0.05），且随时间延长，上调作用更加明显；作用48h、72h时，与其它浓度相比，20n

7、mol/L雷帕霉素处理组对Bcl-2基因表达的上调最明显（P<0.05）；7.与各时间段对照组相比，不同浓度雷帕霉素处理SUP-B15细胞可显著上调Beclin1基因的表达（P<0.05），在100nmol/L雷帕霉素作用72h后，该上调表达的作用最强；8.不同浓度雷帕霉素作用SUP-B15细胞24h后，对HIF-1α表达变化不明显；48h时，10nmol/L和100nmol/L雷帕霉素对HIF-1α表达调控呈上调趋势，而20nmol/L、50nmol/L雷帕霉素则下调HIF-1α基因的表达；72h时，不同浓度雷帕霉素可小幅上调HIF-1α

8、基因的表达；9.不同浓度雷帕霉素作用SUP-B15细胞24h、48h后，均可显著下调VEGF基因的表达（P<0.05），且在24h时下调最明显；72h时，10nmol/L、20n