牛抵抗素多克隆抗体的制备及ELISA检测方法的建立.pdf

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1、·82·生物技术中国畜牧兽医2009年第36卷第1l期牛抵抗素多克隆抗体的制备及ELISA检测方法的建立孙佳，李小兵。孔涛，许超。王照鹏，杨威，刘磊．王哲(吉林大学畜牧兽医学院，长春130062)摘要：用纯化的可溶性重组牛抵抗索蛋白免疫健康家兔，制备了多克隆抗体，并对多克隆抗体进行了纯化、效价测定、特异性检测，初步建立了检测牛抵抗素的间接ELISA方法。关键词：抵抗素；重组蛋白；ELISA中图分类号：S852．4文献标识码：A文章编号：1671—7236(2009)11-0082—03抵抗素(resi

2、stin)是美国科学家Steppan等发现乙烯酶标板(丹麦Nunc公司产品)；ELX800酶标仪的一种由脂肪细胞特异性分泌的具有胰岛抵抗作用(购自美国Bio—TEK公司)。的蛋白质(Steppan等，2001)。Resistin被认为是诱1．4ELISA缓冲液PBS缓冲液(10×)：15．4g导胰岛素抵抗，调节糖代谢和抗脂肪形成的因子，它Na2HPO4·12H2O，2gKH2P0"80gNaC1，2g的发现为研究与胰岛素抵抗有关的疾病提供了新的KCl，溶解后定容至1000mL，调pH至7．2高压灭热点

3、。Resistin能引起胰岛素抵抗(Steppan等，菌后常温保存。包被缓冲液：0．1mol／LNa。CO，2005)，抑制脂肪组织的形成(Kim等，2001)，可能0．1mol／LNaHC03，用Na0H调pH至9．6。封闭作为炎症因子的效应分子参与炎症反应(Savage液：5脱脂奶粉。清洗缓冲液：PBS(pH7．2)，0．05吐温2O。稀释缓冲液：PBS(pH7．2)，等，2001)。另外，Resistin还可能作用于脂肪及肌肉以外的组织，如肝、脑、肾等(Axelsson等，2008)，0．05吐

4、温20，1脱脂奶粉。底物缓冲液：0．2mol／LNa2HPO425．7mL，0．1mol／L柠檬酸24．3并参与食欲调节。为进一步探讨resistin在奶牛能mL，pH5．0，再加5OmL双蒸水。oPD(10mg溶量代谢过程中的作用，建立一种快速有效的检测re—于5mL无水乙醇中)1mL+底物缓冲液9mL+10sistin的方法显得至关重要。试验以纯化的可溶性L3OH2O2。终止液：1mol／LH2SO4。重组牛resistin蛋白免疫家兔，制备抗血清，对各反1．5抗血清的制备选择2～2．5kg家兔4

5、只，预应条件进行了优化，初步建立了检测牛resistin的饲1周后进行免疫，免疫前采血作为阴性对照。免间接EL1SA方法，为进一步研究resistin的生物学疫程序如下：取浓度为2．0mg／mL的抵抗素溶液与活性奠定了基础。等量弗氏佐剂混匀，螺旋混匀器混匀2Orain，乳化l材料与方法成功的标准为取一滴乳化完毕的液体置水面上方不1．1试验动物健康雄性家兔4只(2．5kg／只)，散开。首次免疫取0．5mL的抵抗素溶液与等量弗购自吉林大学实验动物中心。氏完全佐剂充分混匀，每只兔子1．0mL，含抵抗素1．2

6、免疫抗原纯化的可溶性重组resistin蛋白1．0mg，注射部位为2只后脚掌的皮内各注射0．2(自制)，浓度2mg／mL。mL，其余0．6mL分多点注入脊柱二侧、颈部、腹股1．3主要试剂及设备辣根过氧化物酶(HRP)标沟和腋窝等处淋巴结附近部位皮内，每点可注入记的羊抗兔二抗、弗氏佐剂(完全、不完全)(购自0．05mL，分12点注入。第2次免疫在初次免疫后Sigma公司)；邻苯二胺(OPD)、胰岛素、牛血清白蛋20d，取抵抗素溶液与等量的弗氏不完全佐剂混匀，白、脂联素(购自北京鼎国公司)；96孔平底聚苯

7、每只兔子1．0mL，含抵抗素1．0mg，颈背部皮下及臀部皮下多点注射，每点0．1mL。20d后进行第3收稿日期：200903—23次免疫，剂量和免疫部位同上。20d后进行第4次作者简介：孙佳(1984一)，女，山东人，硕士生，研究方向：动物营免疫，剂量和免疫部位同上。2Od后进行加强免养代谢病。通信作者：王哲(1950一)，男，辽宁人，教授，博导，研究方向：动疫，无佐剂抗原1．0mg耳缘静脉注射。加强免疫物营养代谢病与中毒病。后15d进行颈动脉采血，将采得的血液37℃放置1基金项目：国家自然科学基金(

8、30571365)资助项目。h，再转入4℃过夜，待血液充分收缩后迅速分离血中国畜牧兽医2009年第36卷第11期生物技术·83·清，并于4℃，2500r／min离心血液20min，收集上1．7．4最佳封闭时间的确定以最佳抗原浓度和清，分装，一20℃保存备用。包被条件包被酶标板，洗涤后，加人封闭液，15OI／1．6抗体的纯化取20mL血清，加入0．15mol／孔，分成6组。第1组：37℃封闭4h；第2组：37℃LPBS(pH7．2)20mL，再逐滴加入(N