牛传染性鼻气管炎病毒的荧光PCR检测方法.pdf

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1、江苏农业科学2013年第41卷第1期．——45．-——蒋珊珊，赵莎莎，狄和双，等．牛传染性鼻气管炎病毒的荧光PCR检测方法[J]．江苏农业科学，2013，41(1)：45-47牛传染性鼻气管炎病毒的荧光PCR检测方法蒋珊珊-一，赵莎莎，狄和双，陈文芳，王捍东(1．江苏畜牧兽医职业技术学院，江苏泰州225300；2．扬州大学兽医学院，江苏扬州225009)摘要：为利用荧光定量PCR技术建立一种快速检测牛传染性鼻气管炎病毒的方法，根据牛传染性鼻气管炎病毒保守基因和gE分别设计2对引物及相应的Taqman探针，建立、优化反应体系后，利用lO倍稀释法检验方法的灵敏度，

2、建立相对定量标准曲线，并进行特异性检验。结果表明，2组荧光PCR的标准曲线相关性好，相关系数均为0．99，此方法特异性、灵敏性好。关键词：牛传染性鼻气管炎；荧光PCR；特异性；灵敏性中圈分类号：$858．23文献标志码：A文章编号：1002—1302【2013)01—0045—02牛传染性鼻气管炎(infectiousbovinerhinotraeheitis，mR)1材料与方法是由牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)引起牛的一种呼吸道疾病，以高热、呼吸困难、鼻炎、鼻窦炎和上呼吸道炎症为主要特1．1材料征”J。本病于1950年首次发现于美国，目前已遍及世界五大牛传

3、染性鼻气管炎病毒(IBRV)标准株由江苏出入境检洲。该病主要的经济损失在于延缓肥育牛的成长和增重，奶验检疫局动物检验实验室提供，伪狂犬病毒(PRV)由南京农牛产乳量减少和流产，急性的IBR感染可继发牛致病性细菌业大学传染病组提供，马立克氏病毒(MDV)和鸭瘟病毒肺炎，给养牛业造成很大的损失。IBR被列为我国进境动物(DPV)疫苗由南京药械厂提供；ExTaqTM酶由大连TaKaRa公检疫二类疫病，在我国与澳大利亚、新西兰等签署的进口牛双司生产，引物和Taqman探针均由大连TaKaRa公司合成。边检疫协议中，均明确规定对IBR进行严格检疫。1．2引物和探针设计I

4、BR可通过空气、媒介物以及病牛的直接接触而传播，主根据GenBank上登录的和基因序列，用Primer要为飞沫、交配和接触传播。在自然界中，牛是唯一自然感染Express2．0设计引物和探针。的宿主。牛感染本病后，在自然条件下不定期排除病毒。gB引物和探针为F：5一rITGGCGCGGACTACGTGTA一长期以来，在进出口检疫和国内疾病监控中，对IBR的检测3，R：5一CCGTGAGG1’ITAGGI℃CACAA一3，T：5一FAM—通常采用血清中和试验或酶联免疫吸附技术检测IBR抗体。CTCGCGGAGCTGGAGGTGATCAG—TAMRA一3；gE弓I

5、物和由于致病因子感染后机体产生抗体需要一段时间，通常为两探针为F：5一GGGCGATrCCrr1’CTGCTATC一3，R：5一TC．周，上述抗体检测方法不利于诊断IBRV急性感染或早期感GATGCTGGCCGAGAAG一3：T：5一FAM—TGCGTCIIG—染的情况。为加强对进口牛的IBR检疫，我国检验检疫部门CAGTCTGAGnTI’I'CGACG—TAMRA一3。已采用对IBR抗体阳性牛进行病毒分离鉴定的措施。但gB和的2对引物的扩增大小分别为102、75bp。将病毒分离培养耗时长，效率低，并且对分离的病毒仍需要特异上下游引物及探针序列分别用BLAST

6、软件(http：／／www．tic．的病毒检测技术进行鉴定。bi．nlm．gov／blast)进行核酸同源性分析，发现全部与对应序本病有潜伏感染和机体长期排毒的性质，使用常规疫苗列完全相符，未发现与其他病毒序列有相似性。也不能阻止持续感染J。随着疫苗研究的发展，出现了一种1．3DNA的提取新型疫苗，此疫苗的基因完全缺失。基因缺失疫苗取上述保存病毒液200IxL，加入裂解液400，混匀，室的毒力减少，但病毒仍可能潜伏，偶尔仍会爆发该病。因此，温放置10min，先后以酚一氯仿一异戊醇(25：24：1)和氯仿建立一套快速、特异、灵敏的检测方法是非常必要的。抽提1次，

7、0．8体积异丙醇沉淀，70％乙醇洗涤，干燥后加入近年发展起来的荧光定量PCR检验诊断技术为快速诊适量的TE溶解。断该病提供了手段。本研究采用r~qman实时定量PCR以1．4荧光PCRgB基因和g基因为检测靶序列，来检测IBRV及分辨gE基荧光PCR反应体系25：含10×Exbufer因缺失疫苗株和野毒株。2．5L，5mmol／LMgC12，350i~mol／LdNTPs，0．5—0．75UTaKaRaExTaq酶，400nmol／L上游引物和4OOnmol／L下游引物，400nmol／L探针，模板1—5，加超纯水至25。95℃预变性5min；95℃1min，

8、62℃15s，40个循环。收稿日期：2