GBT27981-2011牛传染性鼻气管炎病毒实时荧光PCR检测方法.pdf

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1、ICS11．220B41瘩臼中华人民共和国国家标准GB／T27981～2011牛传染性鼻气管炎病毒实时2011-12-30发布荧光PCR检测方法Real—timePCRmethodforthedetectionofinfectiousbovinerhinotracheitisvirus2012-06-01实施宰瞀徽紫瓣訾矬瞥星发布中国国家标准化管理委员会仅1”标准分享网www.bzfxw.com免费下载刖昌GB／T27981—2011本标准按照GB／T1．1—2009给出的规则起草。本标准参考了OIE发布的《陆生动物诊断试验和疫苗手册}(2008版)关

2、于牛传染性鼻气管炎／牛传染性化脓性外阴阴道炎(Chapter2．4．13)的内容。本标准由全国动物防疫标准化技术委员会(SAC／TC181)归口。本标准起草单位：中华人民共和国广东出入境检验检疫局、中华人民共和国江苏出入境检验检疫局。本标准主要起草人：陈茹、刘中勇、林志雄、罗琼、曾碧健、许如苏、姜焱，吴晓薇。标准分享网www.bzfxw.com免费下载1范围牛传染性鼻气管炎病毒实时荧光PCR检测方法GB／T27981—2011本标准规定了牛传染性鼻气管炎病毒(牛疱疹病毒I型，BoHV一1)实时荧光PCR检测方法的技术要求。本标准适用于快速检测牛血样、拭

3、子、精液、动物组织(粘膜、肝、脾，肾、淋巴结、胎盘组织等)和细胞培养物等样品中BoHV-1病毒感染。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注B期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适甩于本文件。GB／T6682分析实验室用水规格和试验方法世界动物卫生组织(OIE)《陆生动物诊断试验和疫苗标准手册》(2008版)关于检测牛冷冻精液中BoHV-1病毒的实时荧光PCR方法3缩略语下列缩略语适用于本文件。BoHV-I：bovineherpesvirustypel，牛痘疹病毒I型。ct

4、值：荧光信号量达到设定的阈值时所经历的循环数。DNA：deoxyribonucleicacid，脱氧核糖核酸。DTT：DL-dithiothreitol，二硫苏糖醇。EDTA：ethylenediaminetetraaceticacid，乙二胺四乙酸。IBR：bovineinfectiousrhinotracheitis，牛传染性鼻气管炎。PBS：phosphatebuffersolution，磷酸盐缓冲生理盐水。PCR：polymerasechainreaction，聚合酶链式反应。SDS：sodiumdodecylsulfate，十二烷基磺酸钠。U

5、DG酶：uracilDNAglycosylase，尿嘧啶DNA糖基化酶。4设备和器材4．1荧光PCR仪。4．2台式冷冻离心机。4。3可调微量移液器：规格10严L、100pL、200pL、1mL。4．4带滤芯微量吸头：规格lopL、100pL、200,uL、1mL。4，5PCR光学反应管。4．6微量离心管。4．7涡旋混匀器。4．8恒温培养箱。4．9冰箱：规格2℃～8℃，--20℃，--80℃。标准分享网www.bzfxw.com免费下载GB／T27981—20114．10恒温水浴箱。5试剂除另有规定，本方法试验用水应按照GB／T6682中规定的二级水，所

6、用化学试剂均为分析纯。5．1引物与探针引物与探针配制采用无DNA酶、无RNA酶水将每条引物与探针配制成100btmol／L储存液，置--20℃或更低温度冻存；使用时取适量配制成10Fmol／L工作液，避免多次冻融。引物与探针序列：gB基因上游引物gB-F：5’TGTGGACCTAAACCTCACGGT3’gB基因下游引物gB-R：5’GTAGTCGAGCAGACCCGTGTC3’gB基因探针：5’[FAM]一AGGACCGCGAGTTcTTGCCGCEBHQl]3’探针5’端标记的报告荧光基团及3’端标记的淬灭基团可根据荧光PCR仪设备等具体情况另行选

7、定。5．2蛋白酶K溶液：配制方法见附录A。5．3柠檬酸钠缓冲液：配制方法见附录A。5．40．5mol／LEDTA：配制方法见附录A。5．50．01mol／LpH7．2PBS：配制方法见附录A。5．610％chelex100：配制方法见附录A。5．7lmol／LDTT：配制方法见附录A。5．82×定量PCR—UDG酶预混液：含60U／mL热启动Taq酶，40mmol／LTr碡HCl(pH8．4)，100mmol／LKCI，6mmol／LMgClz，400btmol／LdGTP，400omol／LdATP，400／zmol／LdCTP，800／zmol／L

8、dUTP，40U／mLUDG。可采用经验证可靠的商品化预混液。5．9核酸抽提试剂盒。5．10无