牛传染性鼻气管炎病毒荧光定量pcr方法建立及其灭活疫苗研究

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1、Universitycode：10223Classifiedcode：S855.3Graduatenumber：XS1233082Confidentialdegree：PublicHeilongjiangBayiAgriculturalUniversityMasterDissertationDevelopmentofreal-timePCRfordetectionofinfectiousbovinerhinotracheitisanddevelopmentofinactivatedvaccinePostgr

2、aduate：QiaoBoSupervisoor：Pro.ZhuZhan-boMajoor：PreventiveVeterinaryResearchdirection：MolecularVirologyCollegeofanimalscienceCollege：andtechnologyDaqingChinaJune,2015摘要牛传染性鼻气管炎(Infectiousbovinerhinotracheitis，IBR)是一种急性、热性、接触性传染病，由牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)引起。临床主要表现为高热

3、、呼吸困难、上呼吸道炎症和母畜流产等。该病虽然致死率低，但对牛的育肥、产奶量和国际贸易有严重影响。建立灵敏、快速、可靠的检测方法，净化牛群，免疫接种疫苗，仍是预防和控制该病的重要措施。由于没有合适的实验动物模型，传统疫苗免疫后仍缺乏有效的免疫效力评价方法。因此，本研究在建立牛传染性鼻气管炎病毒的TaqMan-MGB荧光定量PCR方法的基础上，对健康家兔及灭活苗免疫家兔的病毒侵染进行了初步研究，对于疫苗免疫效力的评价及有效防控本病具有重要的现实意义。本研究首先根据GenBank已公布的IBRVBarthaNu

4、/67株基因序列针对gB基因设计特异性引物和Taqman-MGB探针，建立了检测牛传染性鼻气管炎病毒的TaqMan-MGB荧光238定量PCR方法。结果显示，标准曲线相关系数(R)为0.998，10-10拷贝/μL内具有较好的1线性关系。该方法灵敏度是常规PCR灵敏度的100倍，检测下限为1.49×10拷贝/μL。特异性良好，对牛呼吸道其他病毒无交叉反应。适用于临床疑似样品的快速定量检测。从17份疑似IBR症状的奶牛鼻拭子中，经分离培养，PCR、间接免疫荧光试验试验、微量血清中和实验与基因序列同源性分析鉴定

5、，确定获得一株IBRV，命名为IBRVDQ/14-7.33株。用TCID50为10/100μL的分离株鼻腔接种家兔，用鼻拭子采集第1-14d的鼻腔粘液，每隔7d分离血清。无菌采集第3、5、7、11和49d的剖杀兔组织脏器，荧光定量PCR、病理组织学和免疫组化检测。结果表明，接毒后第2-7d家兔出现临床症状并排毒至第7d，7-14d产生大量IgG抗体并维持数周。病理组织学和免疫组化结果显示，肺脏出现炎性反应，鼻甲骨和肺脏上皮细胞均有病毒复制。研究表明该分离株对家兔有致病性。用BEI灭活IBRVDQ/14分离株

6、，以MontanideISA206佐剂乳化制备灭活疫苗。分别接种断奶仔兔和Balb/c小鼠，进行安全性检验。间隔21d后两次免疫日本大耳家兔，14d后进行攻毒实验。结果表明疫苗安全性良好。攻毒后，免疫组未出现临床症状，免疫组化结果表明该疫苗阻止了分离株对呼吸道粘膜的侵染，免疫保护率为100%。综上所述，本研究成功建立了可用于临床快速检测IBRV的TaqMan-MGB荧光定量PCR方法；证明了IBRVDQ/14分离株对日本大耳家兔有较强的致病性，制备的灭活疫苗安全，可有效阻止病毒对呼吸系统的侵染。为IBRV的

7、防制提供了有效措施。关键词：牛传染性鼻气管炎病毒；荧光定量PCR；致病性；灭活苗IAbstractInfectiousbovinerhinotracheitis(IBR)isanacute,heatandcontagiousdiseasecausedbyinfectiousbovinerhinotracheitisvirus(IBRV).Itsmainclinicalmanifestationsaredyspnea,rhinitisanddamsabortion.Althoughthemortalityra

8、tecausedbythediseaseislow,thereisaseriousimpactonfattening,milkproductionandinternationaltrade.Itisnecessarytoestablishasensitive,rapidandreliablediagnosticmethodanddevelopinactivatedvaccineforpurifytheherd.D