禽传染性支气管炎病毒荧光PCR检测方法的建立.pdf

《禽传染性支气管炎病毒荧光PCR检测方法的建立.pdf》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。

1、贵州农业科学2011，39(I2)：162～164GuizhouAgriculturalSciences[文章编号]1001—3601(2011)12—0765—0162—03禽传染性支气管炎病毒荧光PCR检测方法的建立李丹，杜雄伟，李叶。，李振荣(1．大连民族学院，辽宁大连116600；2．辽宁出入境检验检疫局，辽宁大连116001)[摘要]为给禽传染性支气管炎病毒(IBV)的诊断奠定基础，对特异、敏感、快速的荧光PCR检测方法的建立进行了试验研究。结果表明，该荧光PCR检测方法具有灵敏度高、特异性强、所需时间短(从核酸提取

2、至检测完成，仅需3h左右)，且该方法实行完全闭管式操作，从根本上杜绝了常规PCR扩增产物污染和假阳性的问题，该方法适用于实验室快速检测。[关键词]禽传染性支气管炎病毒；荧光PCR；检测[中图分类号]$852．657[文献标识码]AEstabIishmentofFluOrescentPCRDetectionMethodforlnfectiousBronchitisVirusLIDan，DUXiong—wei，IAYe。，LIZhen—rong(1．DalianNationalitiesUniversity，Dalian，Liao

3、ning116600；2．LiaoningEntry—ExitInspectionandQuarantineBureau，Dalian，Liaoning116001，China)Abstract：ThefluorescentPCRdetectionmethodwithstrongspecificity，highsensitivityandrapiditytodiagnoseIBVwasestablished．ThefluorescentPCRdetectionmethodcanbeoperatedintheclosedtube

4、pattern，whichcancompletelyeradicatecontaminationofamplificationproductsandfalsepositiveintheconventiona1PCRdetectionmethod．Keywords：infectiousbronchitisvirus(IBV)；fluorescentPCR；detection禽传染性支气管炎(InfectiousBronchitis，IB)RT—PCR实行完全闭管式操作，从根本上杜绝了常是目前广泛在鸡群中流行的一种急性、高度接触性

5、、规PCR扩增产物污染和假阳性的问题。笔者等对病毒性传染病，由冠状病毒科冠状病毒属传染性支建立特异、敏感、快速的荧光PCR检测方法进行了气管炎病毒引起。该病主要侵害鸡的呼吸道、泌尿试验研究，以期为禽传染性支气管炎病毒的特异快生殖道、消化道等，会导致鸡的品质和生产效率下速诊断奠定基础。降，甚至造成成年鸡死亡，肉鸡生产性能下降，目前1材料与方法已成为养鸡业中危害最大的病毒性传染病之一l_】]。近年来，随着禽传染性支气管炎病毒(Infec—1．1材料tiousbronchitisvirus，IBV)新致病性的不断出1．1．1毒株、血

6、清及SPF鸡胚M41、H12O疫苗现]、血清型数量的不断增加，且血清型之间没有株均由华南农业大学禽病研究室提供。IBV阳性血或仅有部分交叉免疫性]，给禽传染性支气管炎的清为中国兽医药品监察所产品(呼吸型)。新城疫病诊断和防治带来很多困难。我国目前比较成熟且常毒(NDV)疫苗株、AIV弱毒株均为辽宁出入境检验用的IBV诊断方法主要是血清学方法、病毒中和试检疫局动物检疫实验室保存。SPF鸡胚由辽宁益验(VN)、血凝抑制试验(HI)和酶联免疫吸附试验康生物制品厂提供，在实验室自行孵化至10日龄。(ELIsA)l5]。但这些方法所需时

7、间较长，敏感性较1．1．2主要仪器与试剂低，已严重阻碍了疫病防治的进程，建立敏感、快速、1)仪器。Lightcycler荧光定量PCR仪特异的分子生物学方法势在必行。(Roche)、ABISystem9700型常规PCR扩增仪、凝由于分子生物学及其他学科的发展，普通RT—胶成像分析系统(UVPGelDoc-lt)、高速离心机PCR方法已广泛地应用于检测领域，提高了检测的(Eppendorf)、恒温摇床(BarnsteadLabline)。灵敏度、特异性、检测时间。但普通的RT—PCR检2)试剂。TaqDNA聚合酶、dNTP、p

8、MD18一T、测通常都是根据编码蛋白来设计引物，由于禽传染各种限制性内切酶等均购自宝生物(大连)工程有限性支气管炎病毒高的变异率，很容易引起假阴性而公司。RNA抽提试剂盒为广州华美公司产品。组漏检，而且普通RT—PCR通常采用分步进行并需要织／细胞DNA抽提试剂盒、胶回收试剂