禽传染性支气管炎病毒一步法rt—pcr检测方法的建立及应用

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1、禽传染性支气管炎病毒一步法RT—PCR检测方法的建立及应用禽传染性支气管炎病毒一步法RTPCR检测方法的建立及应用鸡传染性支气管炎（Infectiousbronchitis，IB）是由传染性支气管炎病毒（Infectiousbronchitisvirus，IBV）引起的一种急性、高度接触性传染病，主要侵害鸡的呼吸、泌尿生殖和消化等系统[1]，常给养鸡业带来巨大的经济损失。IBV是单股正链RNA病毒，一般对病毒的扩增都需要先将RNA反转录为cDNA然后再进行PCR扩增，本试验将RTPCR反应中反转录和PCR两个反应所需要的RNA模板、引物等都一次性加到同一个反应管中，同一反应体

2、系中一步完成从反转录到PCR的全部反应，且扩增产物可直接点样电泳，此一步法操作简便，降低操作过程中的污染几率，目前已成为临床上检测和疾病诊断的一个重要发展方向[2]。　　1材料与方法　　1.1病毒　　IBV、IBDV和NDV均由莱山区某公司生物工程中心保存；20份疑似IB病料采自莱山区某养殖场。　　1.2主要试剂　　EasyPureViralDNA/RNAKit和一步法RTPCR检测试剂盒均购自北京全式金生物技术有限公司；其他试剂均为国产分析纯。　　1.3引物设计与合成　　根据GenBank上的禽传染性支气管炎病毒基因组序列设计引物。　　F：5`-GGTATAGTGTGGGT

3、TGCTG-3`，R：3`-CCTTAATACCTTCCTCATTC-5`，扩增片段大小为459bp，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。　　1.4病毒的增殖　　经尿囊腔接种0.2mL10倍稀释的IBV，37℃培养，弃去24h内死亡的，72h后收取尿囊液。　　1.5病毒本文由.Lix0.4L，RNasefreein；94℃30S，55℃30s，72℃min30个循环；72℃10min，PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。　　1.7特异性试验　　用建立的一步法RTPCR分别检测IBV、IBDV和NDV，验证该方法检测IBV的特异性。　　1.8敏感性验证　　将已定量的IB

4、V毒株提取的RNA进行10倍倍比稀释，稀释度分别为101～105，用建立的一步法RTPCR进行检测，验证该方法的敏感性。　　1.9田间试验　　采用建立的一步法RTPCR检测方法，对大规模养殖场2013年采集的3批60份样品进行IBV监测，疑似阳性则用鸡胚分离鉴定，然后用IBV抗血清进行中和试验和琼脂扩散试验以鉴定病毒。　　2结果与分析2.1PCR扩增产物的鉴定　　PCR扩增产物经过1%琼脂糖凝胶电泳，在459bp处可见特异性片段，大小与预期相符，见图1。　　2.2特异性的试验结果用建立的一步法　　RTPCR同时检测IBV、IBDV和NDV，仅IBV可扩增出约500bp的目的基

5、因条带，而IBDV和NDV及阴性对照均未扩增出目的片段，见图2。表明该方法特异性较好。　　2.IBDV；3.NDV；4.为阴性对照　　2.3敏感性的试验结果用建立的一步法　　RTPCR最低可检出稀释度为104的病毒RNA，即约4pg的IBVRNA，见图3。　　2.4田间试验结果　　2013年采集大规模养殖场采集的3批60份样品进行IBV监测，采用所建立的一步法RTPCR检测方法，筛选检测阳性共5份，阳性率为8.33%。样品经鸡胚分离鉴定，然后用IBV抗血清进行中和试验和ELISA试验，结果完全符合。　　3讨论　　近年来，传染性支气管炎病的流行出现了新的特点，其剖检症状不典型，

6、给临床诊断带来很大的困扰，而目前检测IBV的常用实验室方法有病毒分离[3]、琼脂扩散试验[3]、ELISA[4]、RTPCR[5]，这些方法各有优缺点：病原的分离鉴定是临床上诊断IBV的重要方法，但是该方法操作繁琐，检测周期长[6]；琼脂扩撒试验操作简单，但敏感性不高，该方法一般多用于检测IBV抗原，不推荐检测IBV抗体[7]；ELISA检测IBV的优点比一般的血清学试验均敏感，但此法的缺点不能区分抗体是何种毒株刺激机体产生的[1]；RTPCR技术具有灵敏、快速、特异性强、操作简单等特点。　　两步法RTPCR反应一般在PCR仪上先花费1.5h的反转录时间，再停机加入PCR反应

7、试剂进行下一步的PCR反应，操作繁琐，而且花费很多试剂准备试剂、加样。而一步法RTPCR技术只需将反应中反转录和PCR两个反应所需要的RNA模板、引物等都一次性加到同一个反应管中，同一反应体系中一步完成从反转录到PCR的全部反应，且扩增产物可直接点样电泳，此一步法操作简便易行，而且最大限度地降低了外来因素的污染，更适合广大基层大量样品的快速检测。　　本研究根据IBV保守区序列设计1对引物，建立了检测IBV的一步法RTPCR检测方法，结果显示该方法特异性好，灵敏度较高，为今后IB的快速诊断和病原学的研究提