饥饿诱导人胚肾细胞自噬模型的构建.pdf

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1、新医学2015年4月第46卷第4期221基础研究论著饥饿诱导人胚肾细胞自噬模型的构建黄桢钧刘慰华钟赘刘少军【摘要】目的探讨饥饿诱导的人胚肾细胞(HEK293)自噬模型的构建。方法采用Earle’S平衡盐溶液(EBSS)分别处理HEl(293细胞0、1、2、4、8h，显微镜下观察细胞形态变化，蛋白免疫印迹法检测自噬微管相关蛋白轻链(LC)3一Ⅱ／LC3-I和p62的表达；双荧光mRFP—eGFP—LC3(pt-fLc3)质粒转染HEl(293细胞24h后，荧光显微镜观察EBSS饥饿条件下细胞内红色和绿色LC3荧光亮点的变化。结果饥饿处理后，HEK293细胞皱缩、变小变圆，蛋

2、白免疫印迹法可检测到LC3的蛋白表达和LC3一II／LC3一l比值增加；荧光显微镜可观察到细胞内红色和绿色LC3荧光亮点均增加。结论饥饿可成功诱导HEK293细胞自噬，表现为LC3蛋白表达和LC3—1I／LC3一I比值的增加，以及荧光显微镜下细胞内红色和绿色LC3荧光亮点的增加。【关键词】饥饿；自噬；自噬微管相关蛋白轻链3；p62；双荧光检测EstablishmentofHEK293celllinewithstarvation·inducedautophagyHuangZhenjun．LiuWeihua，ZhongYun，Lius0QGuangzhouInstituteo

3、fCardiovascularDisease／DepartmentofCardiology，theSecondAffiliatedHospitalofGuangzhouMedicalUniversity，Guangzhou510260，ChinaCorrespondingauthor，LiuShaojun，E—mail：shaojunliu@yahoo．con【Abstract】ObjectiveToestablishHEK293cellmodelwithstarvation—inducedautophagy．MethodsHEK293cellsweretreatedwi

4、thEarle’Sbalancedsaltsolution(EBSS)for0，1，2，4and8h．Thenthechan—gesincellmorphologywereobservedunderamicroscope．Andtheexpressionlevelsoftwoautophagy—relatedproteinsincludingLC3andp62weredetectedbywesternblotting．AftertransfeetedwithplasmidsencodingmRFP—eGFPtandemfluorescent—taggedLC3(pttLC

5、3)for24h，thechangesinLC3punctalabeledwithredandgreenfluorescencewereobservedunderfluorescencemicroscopywhenHEK293cellswerestarvedinEB—SS．ResultsHEK293cellsshrankobviouslyandbecamesmallerandroundafterstarvation．TheexpressionofLC3proteinandtheratioofLC3．I1／LC3．1wereincreaseddetectedbywester

6、nblotting．ThenumberofLC3punctalabeledwithredandgreenfluorescencewaselevatedunderfluorescencemicroscopy．ConclusionsAutophagyinHEK293cellscanbesuccessfullyinducedbystarvation，manifestedasincreasedexpressionofLC3proteinandenhancedratioofLC3一Ⅱ／LC3一IandelevatednumberofLC3punctalabeledwithredan

7、dgreenfluorescence．【Keywords】Satarvation；Autophagy；LC3；p62；mRFP-eGFP自噬是细胞内的一种蛋白降解途径，即细胞中胞)，以Earle’S平衡盐溶液(EBSS)处理作为饥受损的蛋白质、细胞器被双层膜结构包绕形成自噬饿手段，建立HEK293细胞自噬模型，旨在为自噬体，与溶酶体结合后即可被降解【11。自噬普遍存的研究提供更具有普遍意义的方法学参考_4J。在于真核细胞内，无论是在生理过程还是在病理状态下，均可见自噬现象。研究表明，自噬参与了神材料与方法经退行性疾病、心脏疾病