trpc1参与氯化镉诱导人胚肾细胞凋亡的研究

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1、南方医科大学2009级硕士学位论文TRPCI参与氯化镉诱导人胚肾细胞凋亡的研究TRPC1isinvolvedincadmium—inducedapoptosisinHumanEmbryoKidneycells课题来源：国家自然科学基金资助(NO：30971193)专业名称劳动卫生与环境卫生学学位申请人余少珍指导教师邹飞教授答辩委员会主席蒋义国教授答辩委员会成员余日安教授丁振华教授刘云岗教授孟晓静教授论文评阅人林忠宁教授刘移民教授2012年5月22日广州硕士学位论文TI冲C1参与氯化镉诱导人胚肾细胞

2、凋亡的研究硕士研究生：余少珍指导老师：邹飞教授摘要研究背景镉(Cadmium)是一种有色重金属，它与氧、氯、硫等化学元素形成无机化合物分布于自然界中。镉可以蓄积在植物和动物的体内，并可以通过食物链进入人体，并且在体内缓慢积累。随着工业的迅速发展．镉的生产和使用不断增加，受污染环境中的镉含量也逐年上升。环境中的重金属镉的含量越来越高，其毒性危害之大已经引起人们的普遍重视。镉已被美国国家毒理学计划列为人类致癌物。在现代化工业和科技的飞速发展，镉污染问题已经恶化，并且很显然镉对人体有潜在危害。但到目前为

3、止，慢性镉中毒尚无有效的治疗方法。因此，探索镉中毒的预防和治疗药物就显得尤为重要。镉影响多种细胞活动，比如凋亡，增殖，分化等。细胞凋亡是细胞死亡的基本形式，在多细胞有机体的动态平衡中起着至关重要的作用。钙离子信号通路在许多细胞活动，包括神经分泌，骨骼肌肉收缩，细胞生长和分化中起着重要的作用。另一方面，细胞在外源性和／或内源性因素刺激下，细胞内钙稳态维护细胞正常功能也是非常重要的。因此，研究证明不同细胞内钙浓度变化可诱导细胞凋亡，并且越来越多的证据支持在细胞凋亡进程的早期和晚期阶段：增加细胞内钙离子

4、浓度可以导致细胞凋亡。有研究者通过体内和体外实验表明当镉浓度高于5．OⅢ时，镉可诱导许多组织和器官诱导细胞凋亡，比如肾，肺，睾丸和肝脏。虽然镉诱导的不同细胞摘要类型的细胞毒性和细胞凋亡的研究较多，但确切研究机制尚不清楚。有研究表明镉可在不同层次干扰细胞内钙稳态，也有研究显示镉诱导不同类型细胞的细胞凋亡，是通过增加细胞内钙离子浓度诱导细胞凋亡。现在有越来越多的证据表明，瞬时受体电位(TRPC)通道参与钙离子内流的途径，它被认为是一个重要的细胞内钙离子稳态调节的离子通道；TRPCI可参与非常重要的细胞

5、进程，如细胞增殖和凋亡。然而，TRPCI参与镉诱导人胚肾细胞凋亡仍然不明确。并且镉诱导细胞凋亡的详细机制仍然知之甚少，因此，我们在此研究首次揭示TRPCI在镉诱导人胚肾细胞凋亡中发挥的关键作用。目的本研究通过构建氯化镉(CdCl2)诱导人胚肾细胞(HEK293)凋亡的模型，在此模型基础上探讨TRPCI参与氯化镉诱导人胚肾细胞HEK293凋亡过程及其机制以期为镉中毒的研究和预防控制提供新思路。方法1：通过流式细胞仪检测不同浓度的CdCl2作用HEK293细胞6h后细胞凋亡的情况，以建立CdCl2诱导

6、人胚肾细胞HEK293细胞凋亡的模型。2：通过RT-PCR检测人胚肾细胞HEK293的TRPC通道亚型的表达情况。3：通过脂质体转染TRPC1质粒，分别用RT-PCR和WesternBlot检测TRPCImRNA和蛋白水平的变化，采用流式细胞仪观察细胞凋亡情况，观察上调TRPCI的表达对CdCl2诱导人胚肾细胞HEK293细胞凋亡的影响。4：通过流式细胞仪检测CdCl2对人胚肾细胞HEK293细胞周期的影响。5：采用电感耦合等离子体质谱(ICP．MS)检测加入不同浓度CdCl2后人胚肾细胞HEK2

7、93细胞内镉离子的含量。6：通过过表达上调TRPCI的表达，采用电感耦合等离子体质谱(ICP．MS)检测加入CdCl2后人胚肾细胞HEK293细胞内镉离子的含量。7：使用激光共聚焦显微镜，观察正常人胚肾细胞HEK293加入CdCl2时细胞内钙离子动态变化。硕士学位论文8：通过过表达上调TRPC1，使用激光共聚焦显微镜，观察加入氯化镉后人胚肾细胞HEK293胞内钙离子实时动态变化。结果1．CdCl2可诱导人胚肾细胞HEK293凋亡不同浓度CdCl2处理人胚肾细胞HEK2936小时后，用流式细胞仪检测

8、细胞凋亡率。结果显示，浓度在15gM以上的CdCl2处理6小时后细胞凋亡率与对照组相比明显升高并且具有统计学意义(尸<0．001)。用30山CdCh作用人胚肾细胞HEK293不同时间后，采用蛋白印迹法检测相关蛋白PARP切割片段，结果显示，6小时后切割PARP明显升高。用hoechst33342染色方法检测CdCl2处理人胚肾细胞HEK293后细胞核形态变化。结果显示30州CdCl2作用人胚肾细胞HEK2936小时后，HEK293细胞核出现明显的核浓缩、染色质片段等细胞凋亡的特征性