高效液相法检测细胞内嘌呤含量研究.pdf

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1、HEILONGJIANGMEDICINEANDPHARMACYFeb．2015，Vo1．38No．1·15·高效液相法检测细胞内嘌呤含量研究①刘慧东，李锦莲，武冬梅(1，黑龙江省开拓辐射技术开发公司，黑龙江哈尔滨150001；2．佳木斯大学药学院，黑龙江佳木斯154007)摘要：目的：改进细胞收集方法以提高高效液相法检测细胞内嘌呤的效率。方法：采用高效液相法检测原位和传统两种收集方法获得的细胞质。结果：原位收集获得的MCF一7细胞质中黄嘌呤，次黄嘌呤，腺嘌吟浓度均高于传统收集细胞法获得的MCF一

2、7细胞质相应的嘌呤浓度。结论：与传统的细胞收集法相比，原位细胞收集法更能得到含量较高的嘌呤。关键词：高效液相法；嘌呤；MCF一7细胞中图分类号：R965．2文献标识码：A文章编号：1008—0104(2015)0l一0015—02嘌呤是核苷酸代谢中间产物，细胞内嘌呤含量1．3HPLC测试条件的检测对核苷酸代谢相关生理、病理过程的研究有AscenisRP—Amide柱(250ram×4．0mmID，重要意义_1J。高效液相(HPLC)法是经典的定量5．0m)；DAD检测器；检测波长为254nm；流

3、动相检测方法，然而此法目前采用的细胞收集和前为的磷酸二氢钾溶液，pH=4．0；流速为1．0mL·处理方式复杂，所需细胞大，不仅造成检测价格昂mln～。贵，而且所需时间较长，易造成检测信号的丢失，因2结果与讨论此改进细胞前处理方式，提高信号强度，缩短前处理2．1原位法与传统法收集MCF一7细胞质内嘌呤时间，以便节省细胞培养，保证检测的精确度，具有HPLC法检测重要意义。本文改进了原始的细胞需要消化、离心、图1为HPLC法检测原位收集的MCF一7细胞重悬、裂解的收集过程，直接在培养皿中原位裂解收质中

4、嘌呤碱基信号峰。并与传统收集过程做了比集，大大缩短了实验操作时间，降低了细胞收集所需较。原位收集的MCF一7细胞质(图1一a)高效液费用。相色谱信号峰明显大于传统收集的MCF一7细胞质1实验部分信号峰(图1一b)。1．1试剂与仪器安捷伦1100高效液相色谱仪，美国；HH．CP—T型二氧化碳培养箱，上海一恒科学仪器有限公司；人乳腺肿瘤细胞MCF一7，东北林业大学赠送；优级胎牛血清、DMEM培养基、链霉素和青霉素，Gibco公司；其余试剂均为分析纯。1．2MCF一7细胞的培养和收集MCF～7细胞加适

5、量DMEM培养液，置37℃、5％CO100％饱和湿度的培养箱中培养。将生长状态良好且长满培养皿底的MCF一7细胞按下述两Time，rain种方法收集。图1HPLC检测原位收集获得的MCF一7细胞质中电活性物质的含量传统细胞收集法：将细胞依次进行消化、吹打悬(a)原位收集MCF一7细胞，(b)传统收集法MCF一7细胞浮、离心(1000r·min～，10min)后得细胞沉淀，所细胞浓度：2．0×10cells·mL一得细胞沉淀用pH7．4PBS溶液冲洗3次，然后用适2．2HPLC法测定嘌呤碱基标准曲

6、线量的pH7．4PBS溶液配成细胞悬液并计数。所得见图2。如图2所示，随着嘌呤浓度的增加，高细胞悬液在水浴50℃作用30min后获得待测细胞效液相色谱法检测的峰面积也随着增加，并在O．5质。～100．Og·mL的范围内呈现良好的线性关系。原位细胞收集法：将生长状态良好且长满培养鸟嘌呤、黄嘌呤、次黄嘌呤和腺嘌呤的线性方程线性皿底的细胞用PBS清洗3次，加入适量的pH7．4关系分别为Sguanine=10．3Cguanine(g·mL)，PBS在水浴50℃作用30min后获得待测细胞质。R：0．99

7、9；Sxanthine：21．68Cxanthine(g·mL一①基金项目：黑龙江省教育厅科学研究项目，编号：12511542。作者简介：刘慧东(1963一)女，黑龙江哈尔滨人，大专，工程师。通讯作者：武冬梅(1967一)女，黑龙江佳木斯人，博士，教授，博士研究生导师。E—mail：dmwu@jmsu．edu．(2171。·16·黑龙江医药科学2015年2月第38卷第1期一8．923，R=0．999；Sxanthine=17．55CxanthineCAdenine(Ixg·mL)一3．879，R

8、=0．999。(g·mL)一12．593，R=0．999；SAdenine=32．58图2嘌呤浓度与HPLC峰面积的关系(A)鸟嘌呤，(B)黄嘌呤，(C)次黄嘌呤，(D)腺嘌呤2．3HPLC法测定原位法和传统法收集细胞内嘌呤含量比较表1细胞收集方法对HPLC峰面积的影响(±5。1'1：3)由表1可见，原位收集的MCF一7细胞质中次别为7．4％，7．8％和4．9％。而原位收集的MCF黄嘌呤、黄嘌呤和腺嘌呤的峰面积分别为124．6，一7细胞质中鸟嘌呤的峰面积由28．2相对减少了84．0和157．0，