高效液相色谱分析法.pdf

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1、第第第十十十章章章一、高效液相色谱仪高效液相色谱分析法高效液相色谱分析法高效液相色谱分析法HPLChighperformanceliquid二、高效液相色谱法的特点chromatographfeatureofHPLC三、流程及主要部件第一节第一节第一节generalprocessandmain高效液相色谱的高效液相色谱的高效液相色谱的assemblyofHPLC特点与仪器特点与仪器特点与仪器featureandinstrumentofHPLC2005-12-7概述——HPLC高效液相色谱是一种以液体作为流动相的色谱技术。在经典柱

2、色谱法的基础上，引入了气相色谱法的理论，在技术上使用了高压泵、高效固定相和高灵敏度检测器，实现了分析速度快，分离效率高和操作自动化。其原理是由流动相液体将被分离混合物带入色谱柱中，根据各组分在固定相及流动相中吸附能力、分配系数、离子交换作用或分子尺寸大小的差异进行分离。由于高压输液泵、高灵敏度检测器和高效固定相的使用，提高了柱效率，降低了检出极限，缩短了分析时间。常规分析一个样品仅需数分钟至数十分钟，较经典柱色谱快100一1000倍2005-12-7高效液相色谱法与气相色谱法比较：（1）气相色谱法分析对象只限于分析气体和沸点较低

3、的化合物，它们仅占有机物总数的20％。高效液相色谱法分离对象是高沸点、热稳定性差、摩尔质量大的物质，占有机物总数近80％。(2)气相色谱采用流动相是惰性气体，它对组分没有亲和力，即不产生相互作用力，仅起运载作用。高效液相色谱法中流动相可选用不同极性的液体，选择余地大，它对组分可产生一定亲和力，并参与固定相对组分作用的剧烈竞争，流动相对分离起很大作用，相当于增加了一个控制和改进分离条件的参数，这为选择最佳分离条件提供了极大方便。2005-12-7(3)气相色谱一般都在较高温度下进行的，而高效液相色谱法则经常可在室温条件下工作。高效

4、液相色谱法是吸取了气相色谱与经典液相色谱优点，并用现代化手段加以改进，因此得到迅猛的发展。目前高效液相色谱法已被广泛应用于分析对生物学和医药上有重大意义的大分子物质，例如蛋白质、核酸、氨基酸、多糖类、植物色素、高聚物、染料及药物等物质的分离和分析。高效液相色谱法的仪器设备费用昂贵，操作严格，这是它的主要缺点。2005-12-7一、液相色谱仪器一、液相色谱仪器一、液相色谱仪器highperformanceliquidchromatograph2005-12-7液相色谱仪（液相色谱仪（液相色谱仪（222）））2005-12-7液相色

5、谱仪（液相色谱仪（液相色谱仪（333）））2005-12-7液相色谱仪（液相色谱仪（液相色谱仪（444）））2005-12-7二、二、二、高效液相色谱法的特点高效液相色谱法的特点高效液相色谱法的特点featureofHPLC特点：高压、高效、高速、高灵敏度、高度自动化是对高沸点、热不稳定有机及生化试样的高效分离分析方法。2005-12-7⑴高压经典液相色谱法，流动相在常压下输送，液体流经色谱柱时，受到的阻力较大。在现代液相色谱法中，流动相改为高压输送（最高压力可达4.9107Pa），所以高压是高效液相色谱法的特点之一。⑵高速由于

6、使用高压泵输送流动相、采用梯度洗脱装置、用检测器在柱或直接检测洗出液成分等原因，HPLC完成分离分析的时间只需几分钟到几十分钟，比经典液相色谱法要快得多。⑶高效由于使用了细粒度的高效填充剂和均匀的填充技术，高效液相色谱法分离效率极高，柱效一般可达每米104理论塔板数。近几年来出现的微型填充柱（内径1mm）和毛细管色谱柱（内径0.05mm），柱效超过了每米105理论塔板数，能够实现极为有效的分离。2005-12-7⑷高灵敏度采用紫外、荧光、电化学等高灵敏度的检测器，使HPLC的灵敏度可以与气相色谱法媲美。最小检测量UV可达10-9

7、g；荧光可达10-11g；光电二极管阵列检测器，除了具有与UV基本相同的灵敏度外还可提供三维色谱图、多波长色谱图；激光诱导—荧光检测器，灵敏度可达到10-23摩尔，也就是说可检测单个分子数量级。除此之外，所需试样少，微升数量的就足以满足进行全分析。⑸高度自动化现代先进的高效液相色谱仪配有计算机，不仅能够自动处理数据、绘图、和打印分析结果，而且能够对仪器的全部操作包括流动相的选择、流速、柱温、检测器波长选择、进样、梯度洗脱方式等进行程序控制，成为全自动化的仪器。2005-12-7三、流程及主要部件三、流程及主要部件三、流程及主要部

8、件processandmainassemblyofHPLC1.流程2005-12-72005-12-72.主要部件（1）输液系统由流动相贮液器、高压泵、梯度洗脱装置、压力表组成，其作用是保证流动相能正常工作。高压输液泵——是将溶剂贮存器中的流动相以高压的形式连续