大黄鱼肌肉生长抑制素基因原核表达及多克隆抗体的制备.pdf

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1、第30卷第2期台湾海峡V01．30．No．22011年5月JOURNALOFOCEANOGRAPHYINTAIWANSTRAITMay，2011大黄鱼肌肉生长抑制素基因原核表达及多克隆抗体的制备董海阳，叶秀丽，薛良义，DialloAmadou(宁波大学生命科学与生物工程学院，浙江宁波315211)摘要：肌肉生长抑制素抑制动物肌肉的生长发育．根据本实验室克隆的大黄鱼(Pseudosciaenacr0．cea)肌肉生长抑制素(MSTN)基因编码序列设计引物，用RT—PCR扩增目的片段，构建MSTN—pET一28a重组表达质粒，将其转化到

2、大肠杆菌BI21上并用1．0mmol／dm。IPTG诱导表达．SDS．PAGE电泳检测该目的蛋白大小约为44kDa，与理论值大小符合．用0．25mo~dmKC1染色后从凝胶中切取该蛋白且回收．该回收蛋白与弗氏佐剂等量混合后注射ICR小鼠制备多克隆抗体，并用Westemblot检测该抗体．免疫印迹结果在44kDa的位置上出现棕色条带，表明大黄鱼肌肉生长抑制素的多克隆抗体制备成功．这为今后对肌肉生长抑制素功能的研究奠定了基础．关键词：海洋生物学；肌肉生长抑制素；原核表达；多克隆抗体；免疫印迹；大黄鱼DOI：10．3969／J．ISSN．

3、1000—8160．2011．02．007中图分类号：Q178．53文献标识码：A文章编号：lOOO一8160(2011)02-0196-07肌肉生长抑制素(MSTN)又称为生长分化因子一抗体还可以改善小鼠萎缩肌肉的功能]．用体外表8(growthdifferentiationfactor一8，GDF一8)，属于转化生达的肌肉生长抑制素前肽处理鱼类，可抑制肌肉生长因子一13(transfominggrowthfactor—p，TGF—B)超家长抑制素的作用，促进鱼类的生长]．族，由美国学者Mepherron等在1997年首次发大黄鱼

4、(Pseudosciaenacrocea)是我国重要的海现⋯．肌肉生长抑制素基因由3个外显子组成，编水养殖鱼类，具有较高的经济价值．但经过多年养殖码376个氨基酸，包括1个信号肽序列、N端TGF—B后，养殖大黄鱼群体出现了明显的衰退现象，如生长前肽结构域、1个RXXR蛋白酶水解位点和C端缓慢、性成熟提早、亲鱼个体变小及肉质变差等．这TGF．B成熟肽结构域．其中最保守的区域为TGF—p些因素直接影响到大黄鱼的产量、销售和商品价格．成熟肽结构域，含有9个保守的半胱氨酸位点．肌肉因此，我们有必要加强对它的生物学研究．在本实验生长抑制素的主

5、要功能是负向调控肌细胞的生长与室克隆大黄鱼肌肉生长抑制素基因的基础上，我们分化引，在成肌细胞生长的Gl期发挥作用，抑制对该基因进行了体外表达，并用表达产物制备了多细胞进入S期并影响成肌细胞从G2期进入到M克隆抗体．期j，从而调控成肌细胞的细胞周期．通过人为调控肌肉生长抑制素的功能活动，可1材料与方法以控制动物肌肉的生长发育．在核酸水平上，肌肉生1．1菌株和质粒长抑制素基因敲除的小鼠体重是正常野生型的2～3DH5cx、BL21大肠杆菌和pET-28a载体为北京倍⋯．鱼类干扰肌肉生长抑制素基因的表达也可以天恩泽基因科技有限公司产品．pM

6、D18一T载体为产生双肌型的斑马鱼』．在蛋白质水平上，给小鼠Takara公司产品．注射肌肉生长抑制素抗体，可增强小鼠肌肉的发育，1．2主要试剂和工具酶其体重比对照组增加了约10％6．肌肉生长抑制素TaqDNA聚合酶、BamHI和HindIU限制性内收稿日期：2010-09—14基金项目：国家自然科学基金资助项目(30871916)；国家863计划资助项目(2006AA10A405)作者简介：董海阳(1986一)，男，硕士研究生；E—mail：yexlld@163．corn通讯作者：薛良义，教授；E—mail：xueliangyi@n

7、bu．edu．cn2期董海阳，等：大黄鱼肌肉生长抑制素基因原核表达及多克隆抗体的制备‘197·切酶、T4DNA连接酶、PCR试剂、cDNA第一链合成的转速震荡培养1h，最后取120mm的培养液涂氨试剂盒和低分子量蛋白Marker均为Takara公司产苄(Amp)平板，Amp的终含量为100g／em．在品．质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒、DNAMarker和37℃培养14h之后挑菌进行PCR检测，取阳性克隆Westernblot试剂盒、Trizol等均为上海生工的产品．菌在含Amp(100Ixg／cm)的LB培养液中扩大培1．3引物设计

8、养，并测序验证．根据本实验室克隆到的大黄鱼肌肉生长抑制素1．7基因重组表达基因序列(AY842933)设计引物，上游引物为W1一将过夜培养的MSTN—pMD18一T—DH5a和pET一BamHI：5’一CGGGATCCGACCAAGA