含EGFP报告基因单顺反子HCV亚基因组复制子载体的构建和表达-论文.pdf

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1、中国病原生物学杂志2014年5月第9卷第5期Journalo／’PathogenBiologyMay2014．Vo1．9，N0．5·389·DOI：10．133含50／j．cEjpbG．14F05P02报告·论著·基因单顺反子HCV亚基因组复制子载体的构建和表达*陈中湘，刘晓蕾，刘丽莎，崔光晶，邬国军，马琼山，刘水平一(中南大学湘雅医学院微生物学系，湖南长沙410078)【摘要】目的构建含增强型绿色荧光蛋白(EGFP)报告基因的HCV复制子表达载体，并实现其在细胞中的复制表达。方法用分子生物学基因克隆技术对HCV2a型复制子的基因进行改造，用EGFP基因替代HCV基因组中的包膜

2、基因(E1和E2)体外构建重组单顺反子HCV亚基因组复制子真核表达质粒pcDNA-JFH1一EGFP，经限制性内切酶酶切分析和测序鉴定；脂质体介导转染人肝癌细胞系Huh一7细胞，用荧光显微镜观察EGFP表达，采用半定量RT—PCR方法检测重组复制子的HCVRNA负链，采用Westernblot检测HCVNS3蛋白的复制表达，并观察IFN—a对重组质粒表达的HCVRNA复制的抑制作用。结果构建的4个重组质粒酶切分析与预期相符，HCV亚基因复制子表达载体中未发生EGFP和HCV编码区读码框架改变，转染重组载体Huh-7细胞检测到HCV负链及EGFP和HCVNS3蛋白表达。转染后48

3、h，l000Iu／ml和2000Iu／mlIFN-a处理的细胞HCVRNA表达水平分别为未处理组的20．O和7．6。结论含EGFP报告基因的单顺反子HCV亚基因组复制子表达载体pcDNAJFH1一EGFP构建成功，在Huh一7细胞中能有效复制表达，为进一步研究HCV提供了实验平台。【关键词】丙型肝炎病毒；复制子；绿色荧光蛋白；基因表达【中图分类号】R373．21【文献标识码】A【文章编号】1673—5234(2014)05—0389—05[JournalofPathogenBiology．2014May；9(5)：389393，399．]Developmentofamonoci

4、stronicHCVsubgenomicrepliconwiththeEGFPreportergeneanditsexpressioninculturedcellsCHENZhong—xiang，LIUXiao—Iei，LIULisha，CUIGuang—jing，WUGuo—jun，MAQlong—shan，LIUShui—ping(DepartmentofMicrobiology，XiangyaSchoolofMedicine，CentralSouthUniversity，Changsha4l0078。China)[Abstract]ObjectiveTodevelopan

5、HCVsuhgenomicrepliconcontainingtheEGFPreportergenethatreplicateseffi—cientlyinculturedcells．MethodsMolecularcloningwasusedtosubstituteaDNAfragmentencodingEGFPforHCVenvelopegenesE1andE2inaeukaryoticexpressionvectorofthefull—lengthHCVrepliconinordertogenerateamono—-cistronicHCVsubgenomicreplic

6、onwiththeEGFPreporter，designatedpcDNA—JFH1一EGFP．Thissubstitutionwasveri—fledusingenzymaticdigestionandDNAsequencing．ThepcDNA—JFH1一EGFPwastransfectedintoHuh一7humanhepato—macellsusingliposomemediation，andEGFPexpressionintransfectedcellswasexaminedusingfluorescencemicroscopy．Minus—strandRNAandt

7、heNS3proteinofHCVwererespectivelydetectedusingsemi-quantitativeRT—PCRandWesternblotanalysis．InhibitionofrecombinantplasmidDNA-basedHCVRNAreplicationbyIFN一wasalsoinvestigated．Re—suitsEnzymaticdigestionoffourrecombinantplasmidswasinlinewithexpectatio