报告基因载体

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1、报告基因载体(1)报告基因载体的特点：除了具有表达蛋白质所需要的结构外，理想的报告基因载体本身无调节结合位点或序列，而具有有意插入的调节结合位点，尽管可以从报告基因载体除去已知的结合位点，减少报告基因上游的转录，但从几千kb的DNA中去除所有潜在的调控序列是不可能的。因此在使用报告基因载体时，应使用合适的对照载体。报告基因质粒载体一般在大肠杆菌中繁殖，因此包括一个DNA复制起始点(ori)和基因筛选标记，通常为氨苄西林抗性基因(Ampr)。另外还具有丝状噬菌体复制起始点(flori)，可使载体形成单链DN

2、A，便于基因突变和测序。(2)报告基因和侧翼区：报告基因编码区和侧翼区常被改变。例如，去除SEAP（分泌型碱性磷酸酶）羧基末端24个氨基酸，使SEAP能直接分泌到细胞外，因此测定SEAP活性不必裂解细胞。去除荧光素酶的过氧化物酶体靶向序列，使荧光素酶转运到细胞质而非过氧化物酶体中。为了使报告基因表达最大化，核糖体最佳结合序列(GCCGCCCCATG)被置于报告基因的5’端。此序列能增加翻译效率，产生NcoI酶切位点，可使外源基因N末端与报告基因融合。(3)多克隆位点：许多报告基因含有2个以上克隆位点(MC

3、S)，一个位于报告基因上游，用于插入假定的克隆启动子或增强子／启动子区；另一个位于其他位置，用于插入克隆调控元件，例如插入可远距离发挥作用的增强子。另外，还有用于插入基因筛选标记的克隆位点，用于筛选稳定表达报告基因的宿主细胞。MGS具有几个单酶切位点，用限制性内切酶催化可产生黏性末端。DNA片段可插到此位点。MCS还包括一个或两个MCS末端，此末端序列可由限制性内切酶催化断裂形成3’悬垂末端，可用核酸外切酶Ⅲ进行嵌套缺失分析。(4)多聚腺苷酸信号：多聚腺苷酸(polyA)可增强哺乳细胞mRNA稳定性和mR

4、NA的翻译。polyA序列紧随报告基因之后，可指导RNA转录物3’端添加200～250个腺苷酸残基。在转录单位5’端插入polyA信号能降低源于载体的隐匿启动子序列基因表达水平，去除背景表达，增加报告基因系统的灵敏性。在报告基因转录单位上游3个阅读框中均插入终止密码子，可进一步降低源于载体的假转录背景。常见的报告基因报告基因必须具备的特点：①由原核基因编码的基因产物必须与同转染前真核细胞内任何相似的产物相区别；②细胞内其他基因产物不会于扰报告基因产物的检测；③报告基因编码产物的检测应该快速、简便、灵敏度高

5、，而且重现性好。到目前为止，报告基因通常是在报告基因载体质粒中与被检测基因序列相连，先让质粒在大肠杆菌中进行增殖，再提取质粒，转染人感兴趣的真核细胞中。与此同时，还要将有真核启动子和增强子的另一种报告基因质粒共转染同一细胞，作为转染率的内对照。(1)氯霉素乙酰基转移酶(CAT)该报告基因来源于大肠杆菌转位子9，是第1个用于检测细胞内转录活性的报告基因。氯霉素乙酰基转移酶可催化乙酰CoA的乙酰基转移到氯霉素3羟基，而使氯霉素解毒。CAT在哺乳细胞无内源性表达，性质稳定，半衰期较短，适于瞬时表达研究。可用同位

6、素、荧光素和酶联免疫吸附测定(enzyme-linkedimmunosorbantassay，ELISA)检测其活性，也可进行蛋白质印迹(Westernblotting)和免疫组织化学分析。CAT与其他报告基因相比，线性范围较窄，灵敏性较低。(2)β半乳糖苷酶：β半乳糖苷酶由大肠杆菌lacZ基因编码，可催化半乳糖苷水解。最大优势是易于用免疫组织化学法观测其原位表达，是最常用的监测转染率的报道基因之一。以邻—硝基苯—β—D—半乳吡喃糖苷(ONPG)为底物可用标准的比色法检测酶活性，其检测动力学范围为6个数量

7、级。氯酚红—β—D—半乳吡喃糖苷(CPRG)是另一个可用比色法检测酶活性的底物，其灵敏度比ONPG高近10倍。以MUG和荧光素二半乳糖苷(FDG)为底物则可用荧光法检测其活性。此法可检测单个细胞的酶活性，并可用于流式细胞学(FACS)分析。如以二氧杂环丁烷为底物，可用化学发光法检测酶活性，其检测动力学范围最大，灵敏度最高，与用生物发光法检测荧光素酶活性的灵敏度相似。(3)荧光素酶：荧光素酶是能够催化不同底物氧化发光的一类酶，哺乳细胞无内源性荧光素酶。最常用的荧光素酶有细菌荧光素酶、萤火虫荧光素酶和Reni

8、lla荧光素酶。细菌荧光素酶对热敏感，因此在哺乳细胞的应用中受到限制。萤火虫荧光素酶灵敏度高，检测线性范围宽达7～8个数量级，是最常用于哺乳细胞的报道基因，用荧光比色计即可检测酶活性，因而适用于高通量筛选。随着具有膜通透性和光裂解作用的萤火虫荧光素酶的应用，无需裂解细胞即可检测酶活性。Renilla荧光素酶催化肠腔素(coelenterazine)氧化，产物可透过生物膜，可能是最适用于活细胞的报告分子。将荧光素酶报告基因载体转