通用腺伴随病毒载体的构建及表达报告基因gfp的实验研究

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1、通用腺伴随病毒载体的构建及表达报告基因GFP的实验研究郑国玺，韦俊荣，祝康，侯瑾，施典羽，朱宏亮，杨广笑，王全颖【关键词】重组腺伴随病毒；载体；报告基因；基因治疗；NIH3T3　　摘要：目的构建基因治疗通用型腺伴随病毒(AAV)载体并检测其转染外源基因作用。方法使用限制性内切酶切除pSSV9int质粒中的AAV病毒Rep和Cap基因元件后，插入了重组腺病毒专用穿梭质粒pACCMVpLpA的含有CMV启动子、多克隆位点(MCS)和多聚腺苷酸信号(PolyA)的表达盒，构建了重组AAV通用载体质粒pSSHGCMV。在该质粒MCS插入绿色荧光蛋

2、白(GFP)基因后，使用pSSHGCMVGFP、GFP140和pAAV/Ad三种质粒共转染293包装细胞，制备GFP重组AAV。应用斑点杂交实验检测重组病毒滴度，并将该病毒感染新生大鼠NIH3T3细胞，荧光显微镜观察GFP表达。结果重组AAV的滴度在浓缩前可达2×1011cfu/mL，浓缩后可达2×1013cfu/mL，表明成功地构建了重组AAV载体。插入外源基因GFP后，在包装病毒和辅助质粒的联合作用下，能产生具有感染性的重组AAV。感染了重组GFPAAV的大鼠NIH3T3细胞表达了明显的GFP荧光。结论构建的重组AAV通用载体pSSH

3、GCMV可转染外源基因，这为进一步的基因治疗奠定了基础。　　关键词：重组腺伴随病毒；载体；报告基因；基因治疗；NIH3T3　　ConstructionofagengeraladenoassociatedvirusvectorandGFPexpressioninratNIH3T3transducedbytherAAVvector　　ABSTRACT:ObjectiveToconstructauniversaladenoassociatedvirus(AAV)vectorandtodetecttheabilityoftherAAVvector

4、totransfergeneintothetargetcell.MethodsByusingrebinanttechnique,thegeneelementsofAAVRepandCapgenesbetidid,arebinantadenovirusshuttlevector.TheexpressingcassetteincludedaCMVpromoter,amulticloningsites(MCS)andapolyAsignal.TheneidconstructededpSSVHGCMV,id,therAAVvectorexpres

5、singGFP,pSSVHGCMVGFPplasmid,havebeenconstructedandthenitintroducedinto293cellbymethodofCa3(PO4)2usingthreeplasmidsofpSSVHGCMVGFP,pGF140andpAAV/Ad.AfterthecellicroscopafterthecellL,anditesinrAAVconcentratedthanitdidinrAAVstock.TheNIH3T3infectedrGFPAAVexpressedsignificantly

6、GFPfluorescence,id,cantransferexteriorgeneintothetargetcellusingproceedingofrebinantAAVanditmaybeusedinresearchofgenetherapy.　　KEYV，可转导外源基因，为进一步用于感音神经性耳聋的基因治疗奠定了基础。　　1材料与方法　　1.1菌株、质粒、酶及试剂E.coliDH5α、pACCMVpLpA、pFG140辅助病毒质粒和细胞株(293细胞)由西安华广生物工程有限公司提供；骨架质粒pSSV9int-和pAAV/Ad由美国

7、匹斯堡大学生物研究室构建，第四军医大学基础部病理研究室张桐博士惠赠；pGFPN2质粒购于CloningTech公司；牛血清白蛋白、KlenoLpSSHGCMVGFP60μLpAAVAd60μLpFG140120μL双蒸去离子水5.16mL2.5mol/LCaCl2600μL(5%)　　配制方法：按顺序先加入2×HBS(mol/L：15Na2HPO4、10KCl、280NaCl、12葡萄糖、50HEPES,pH7.0)。液体配制完毕放置30min，然后加至80%融合的293细胞的培养瓶中，转染5h后，倒掉磷酸钙培养液，并用3-5mL培养液洗

8、3遍。加入10mL含10%(体积分数)小牛血清的细胞培养液，置37℃、5%(体积分数)CO2孵箱培养72h后，收获细胞，回收重组病毒颗粒。斑点杂交法测定重组病毒滴度。　　图1pSSHGCMV及