通用腺伴随病毒载体的构建及表达报告基因GFP的实验研究.doc

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1、通用腺伴随病毒载体的构建及表达报告基因GFP的实验研究作者：郑国玺，韦俊荣，祝康，侯瑾，施典羽，朱宏亮，杨广笑，王全颖【关键词】重组腺伴随病毒；载体；报告基因；基因治疗；NIH3T3　　摘要：目的构建基因治疗通用型腺伴随病毒(AAV)载体并检测其转染外源基因作用。方法使用限制性内切酶切除pSSV9int质粒中的AAV病毒Rep和Cap基因元件后，插入了重组腺病毒专用穿梭质粒pACCMVpLpA的含有CMV启动子、多克隆位点(MCS)和多聚腺苷酸信号(PolyA)的表达盒，构建了重组AAV通用载体质粒pSSHGCMV。在该质粒MCS插入绿色荧光蛋白(GFP)基因后，使用pSSHGCMVGF

2、P、GFP140和pAAV/Ad三种质粒共转染293包装细胞，制备GFP重组AAV。应用斑点杂交实验检测重组病毒滴度，并将该病毒感染新生大鼠NIH3T3细胞，荧光显微镜观察GFP表达。结果重组AAV的滴度在浓缩前可达2×1011cfu/mL，浓缩后可达2×1013cfu/mL，表明成功地构建了重组AAV载体。插入外源基因GFP后，在包装病毒和辅助质粒的联合作用下，能产生具有感染性的重组AAV。感染了重组GFPAAV的大鼠NIH3T3细胞表达了明显的GFP荧光。结论构建的重组AAV通用载体pSSHGCMV可转染外源基因，这为进一步的基因治疗奠定了基础。　　关键词：重组腺伴随病毒；载体；报告

3、基因；基因治疗；NIH3T3　　ConstructionofagengeraladenoassociatedvirusvectorandGFPexpressioninratNIH3T3transducedbytherAAVvector　　ABSTRACT:ObjectiveToconstructauniversaladenoassociatedvirus(AAV)vectorandtodetecttheabilityoftherAAVvectortotransfergeneintothetargetcell.MethodsByusingrecombinanttechnique,thege

4、neelementsofAAVRepandCapgenesbetweenITRsofpSSV9int-plasmidwerereplacedbyexpressingcassetteinpACCMVpLpAplasmid,arecombinantadenovirusshuttlevector.TheexpressingcassetteincludedaCMVpromoter,amulticloningsites(MCS)andapolyAsignal.ThenewplasmidconstructedwasnamedpSSVHGCMV,whichwasauniversaladenoassoc

5、iatedvirus(AAV)vector.AfterGFPreportgenewasinsertedintoMCSoftheplasmid,therAAVvectorexpressingGFP,pSSVHGCMVGFPplasmid,havebeenconstructedandthenitintroducedinto293cellbymethodofCa3(PO4)2usingthreeplasmidsofpSSVHGCMVGFP,pGF140andpAAV/Ad.Afterthecellwastransfectedfor72h,therAAVwasharvestdandthetitr

6、ationsofrAAVstocksandrAAVconcentratedweredetectedbydotblottestusingdigGFPprobe.TheGFPexpressioninratNIH3T3wasobservedbyfluorescencemicroscopafterthecellwasinfectedfor24,48and72h.ResultsTitrationofrAAVstockproducedusingnew6rAAVvectorandprocedurerangedbetween1×1011and2×1012totalpracticles/mL,anditw

7、asincreased100timesinrAAVconcentratedthanitdidinrAAVstock.TheNIH3T3infectedrGFPAAVexpressedsignificantlyGFPfluorescence,whichshowedthatrGFPAAVwasinfectiousvirions.ConclusionTherAAVvectorconstructedinthispaper,pSSHGCMVp