血管生成素1和报告基因egfp双基因共表达腺病毒的构建的论文

《血管生成素1和报告基因egfp双基因共表达腺病毒的构建的论文》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、血管生成素1和报告基因EGFP双基因共表达腺病毒的构建的论文作者：孟国林，段春光，刘建，吕昌伟，杨旻，袁志，胡蕴玉【摘要】目的：构建并制备血管生成素1和egfp双基因共表达重组腺病毒载体.方法：采用基因克隆技术克隆目的基因ang1，并将得到的基因亚克隆至含有报告基因egfp的穿梭载体padtrackcmv；使用padeasy1腺病毒系统将含有目的基因的穿梭载体与腺病毒骨架质粒在细菌bj5183中同源重组，产生重组腺病毒载体；线性化重组的腺病毒转染入qbi293a细胞中对重组的腺病毒进行包装

2、并扩增.结果：ang1基因与腺病毒穿梭载体连接成功，经xhoi/ecorv双酶切后琼脂糖电泳可见在1.5kb处出现特异性条带，证明padtrackcmvang1重组质粒构建成功；重组的穿梭载体与padeasy1质粒重组后，产物经paci酶切后琼脂糖电泳可见一大一小两个片段.大小约为30kb和4.5kb，与预期结果相符，证明重组腺病毒padang1egfp构建成功；线性化重组的腺病毒转染入qbi293a细胞后包装成功.扩增后病毒滴度为2×1014v.g./l，egfp活性检测腺病毒感

3、染细胞阳性率在30%以上.结论：成功制备了padang1egfp腺病毒.为骨组织工程血管化的研究打下基础.【关键词】血管生成素；腺病毒；基因转染；增强型绿色荧光蛋白0引言大段骨缺损的修复一直是临床上难以解决的难题，而缺乏足够的血运是其难以修复的重要原因.因此血管化的研究在大段骨缺损的研究中显得极为重要.血管的形成可分为血管发生和血管生成，成熟个体形成血管的唯一方式是血管生成，而ang1在这一过程中起着重要的调节作用［1-2］.所以对于ang1的研究对于大段骨缺损的治疗显得极有意义.本研究中

4、，我们设计、构建了携带ang1基因的腺病毒（adenovirus），为探索大段骨缺损的血管化打下了基础.1材料和方法1.1材料pcdna3.1(+)真核表达载体由本室保存，质粒padtrackcmv(含egfp基因)、padeasy1,菌种bj5183购自stratagene公司；293a细胞株、转染试剂(lipofectamine2000)购自invitrogen公司.各种限制性内切酶，t4连接酶、反转录酶primescripttmreversetranscriptase,dna聚合酶（pr

5、imestartmhsdnapolymerase）,pmd18tvector购自takara公司.质粒小量提取试剂盒、琼脂糖凝胶回收试剂盒购自（omegabiotek）公司,mrna提取试剂（polyatractsystem1000）,mmlv购自promega公司.1.2方法1.2.1血管生成素1（ang1）基因的克隆及鉴定①在genebank上查询ang1的序列为nm_001146.根据此序列设计引物.引物序列为：f:ccgctcgagatgacagttttcctttcc,r:ttt

6、gatatctcaaaaatctaaaggtcg上游引物引入xhoⅰ位点，下游引物引入ecorⅴ位点.②rna的提取及cdna的获得：使用polyatractsystem1000试剂盒从胎盘组织中提取mrna提取步骤按照说明书进行，将提取的mrna使用反转录酶primescripttmreversetranscriptase反转录为cdna，步骤按照说明书进行.③pcr扩增ang1基因片段：以上述获得的cdna为模板，进行pcr反应.反应条件为98℃10s,65℃5s,72℃2.5min.35个循

7、环.琼脂糖电泳鉴定.④ang1克隆入pmd18tvector，dna测序鉴定：将pcr产物进行凝胶回收纯化后，克隆至pmd18tvector中，将质粒pmd18tang1转化至细菌dh5α中，扩增后送公司测序.1.2.2携带ang1基因和报告基因egfp的腺病毒载体的构建①将基因ang1克隆至腺病毒穿梭载体padtrackcmv：质粒pmd18tang1和穿梭载体padtrackcmv（含有基因egfp）分别进行xhoⅰ/ecorⅴ双酶切，产物胶回收后，按15∶1比例混合，

8、加入t4连接酶进行连接.转化入细菌dh5α，提取克隆进行酶切鉴定.②病毒的重组：先将腺病毒骨架质粒padeasy1转化入细菌bj5183中，得到含有padeasy1的bj5183细菌，将鉴定正确的携带目的基因ang1的穿梭载体转化入含有padeasy1的bj5183中进行同源重组.挑取其中较小的菌落扩增、提取质粒.③重组病毒的鉴定：将重组的质粒paci酶切后进行8g/l琼脂糖电泳，与标准的重组腺病毒酶切谱形进行对比，鉴定得到的重组病毒是否正确.1.2.3重组腺