血管生成素1和报告基因egfp双基因共表达腺病毒的构建

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1、从本学科出发，应着重选对国民经济具有一定实用价值和理论意义的课题。课题具有先进性，便于研究生提出新见解，特别是博士生必须有创新性的成果血管生成素1和报告基因EGFP双基因共表达腺病毒的构建作者：孟国林，段春光，刘建，吕昌伟，杨旻，袁志，胡蕴玉【摘要】目的：构建并制备血管生成素1和EGFP双基因共表达重组腺病毒载体.方法：采用基因克隆技术克隆目的基因ANG1，并将得到的基因亚克隆至含有报告基因EGFP的穿梭载体pAdTrackCMV；使用Padeasy1腺病毒系统将含有目的基因的穿梭载体与腺病毒骨架质粒在细菌BJ5183中同源重组，产生重组腺病毒载体；线性化重组

2、的腺病毒转染入QBI293A细胞中对重组的腺病毒进行包装并扩增.结果：ANG1基因与腺病毒穿梭载体连接成功，经XhoI/EcoRV双酶切后琼脂糖电泳可见在处出现特异性条带，证明pAdTrackCMVANG1重组质粒构建成功；重组的穿梭载体与pAdeasy1质粒重组后，产物经PacI酶切后琼脂糖电泳可见一大一小两个片段.大小约为30kb和，与预期结果相符，证明重组腺病毒pAdANG1EGFP构建成功；线性化重组的腺病毒转染入QBI293A细胞后包装成功.扩增后病毒滴度为2×/L，EGFP活性检测腺病毒感染细胞阳性率在30%以上.结论：成功制备了pAd

3、ANG1EGFP腺病毒.为骨组织工程血管化的研究打下基础.【关键词】血管生成素；腺病毒；基因转染；课题份量和难易程度要恰当，博士生能在二年内作出结果，硕士生能在一年内作出结果，特别是对实验条件等要有恰当的估计。从本学科出发，应着重选对国民经济具有一定实用价值和理论意义的课题。课题具有先进性，便于研究生提出新见解，特别是博士生必须有创新性的成果增强型绿色荧光蛋白0引言大段骨缺损的修复一直是临床上难以解决的难题，而缺乏足够的血运是其难以修复的重要原因.因此血管化的研究在大段骨缺损的研究中显得极为重要.血管的形成可分为血管发生和血管生成，成熟个体形成血管的唯一方式是血

4、管生成，而ANG1在这一过程中起着重要的调节作用［1-2］.所以对于ANG1的研究对于大段骨缺损的治疗显得极有意义.本研究中，我们设计、构建了携带ANG1基因的腺病毒，为探索大段骨缺损的血管化打下了基础.1材料和方法材料(+)真核表达载体由本室保存，质粒pAdTrackCMV(含EGFP基因)、pAdeasy1,菌种BJ5183购自Stratagene公司；293A细胞株、转染试剂(lipofectamine000)购自Invitrogen公司.各种限制性内切酶，T4连接酶、反转录酶PrimeScriptTMReverseTranscriptase,DNA聚

5、合酶,PMD18Tvector购自Takara公司.质粒小量提取试剂盒、琼脂糖凝胶回收试剂盒购自公司,mRNA提取试剂,MMLV购自Promega公司.方法血管生成素1基因的克隆及鉴定①在Genebank上查询ANG1的序列为NM_.根据此序列设计引物.课题份量和难易程度要恰当，博士生能在二年内作出结果，硕士生能在一年内作出结果，特别是对实验条件等要有恰当的估计。从本学科出发，应着重选对国民经济具有一定实用价值和理论意义的课题。课题具有先进性，便于研究生提出新见解，特别是博士生必须有创新性的成果引物序列为：F:CCGCTCGAGATGACAGTTTTCCTTT

6、CC,R:TTTGATATCTCAAAAATCTAAAGGTCG上游引物引入XhoⅠ位点，下游引物引入EcoRⅤ位点.②RNA的提取及cDNA的获得：使用PolyAtractsystem1000试剂盒从胎盘组织中提取mRNA提取步骤按照说明书进行，将提取的mRNA使用反转录酶PrimeScriptTMReverseTranscriptase反转录为cDNA，步骤按照说明书进行.③PCR扩增ANG1基因片段：以上述获得的cDNA为模板，进行PCR反应.反应条件为98℃10s,5℃s,2℃.个循环.琼脂糖电泳鉴定.④ANG1克隆入PMD18Tvector，DNA测序

7、鉴定：将PCR产物进行凝胶回收纯化后，克隆至PMD18Tvector中，将质粒PMD18TANG1转化至细菌DH5α中，扩增后送公司测序.携带ANG1基因和报告基因EGFP的腺病毒载体的构建①将基因ANG1克隆至腺病毒穿梭载体pAdTrackCMV：质粒PMD18TANG1和穿梭载体pAdTrackCMV分别进行XhoⅠ/EcoRⅤ双酶切，产物胶回收后，按15∶1比例混合，加入T4连接酶进行连接.转化入细菌DH5α，提取克隆进行酶切鉴定.②病毒的重组：先将腺病毒骨架质粒pAdeasy1转化入细菌BJ5183中，得到含有pAde