消癌平逆转厄洛替尼非小细胞肺癌耐药的作用机制研究.pdf

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1、浙江中医杂志2014年7月第49卷第7期【实验研究】消癌平逆转厄洛替尼非小细胞肺癌耐药的作用机制研究葛淑瑜陈建张家建陈永利1浙江省立同德医院浙江杭州3100122浙江大学医学院附属第一医院浙江杭州310003关键词消癌平非小细胞肺癌厄洛替尼耐药逆转机制肺癌是我国发病率和死亡率居于首位的恶性肿细胞培养于含1O新生牛血清、100U／ml青霉素和瘤，其中非小细胞肺癌(NSCLC)占了85。酪氨酸激100g／m1．链霉素的RPMI一1640培养液中，37℃、5酶抑制剂(TKI)的出现为NSCLC治疗带来了新的希CO培

2、养箱中常规培养，2～3天传代1次，待三代后稳望，但获得性耐药是制约TKI的主要问题。研究表明定，取对数生长期细胞用于实验。TKI的获得性耐药可能与细胞表皮生长因子受体1．3消癌平非细胞毒剂量摸索：取对数生长期的(EGFR)T790M二次突变以及C—met基因扩增有PC9／G2细胞(2×10／ml，10Ol／孔)接种于96孔板关[】_3l，但针对上述机制所采取的治疗方法，如c-Met内，由低到高浓度分别加入消癌平1、5、lO、20、40mg／抑制剂、不可逆EGFR抑制剂等虽然均有一定逆转ml，以及阴性对照组。每

3、个浓度设3个平行复孔，并设TKI作用，但不可避免地会伴随着毒副作用，或者再次阴性对照组，分别共同孵育24h、48h、72h后，更换新鲜耐药的发生。中药联合靶向药物治疗NSCLC在临床培养液，每孔加人MTT(Smg／L)2Ol，继续培养4h，低上显示了可喜的苗头。消癌平注射液是中药通关藤的温离心(500r／min，10min)，弃上清液，可见蓝紫色结精提取物，生长在我国云南、贵州、广东等山区，其味晶，加入DMSO100gl，摇匀，振荡10min，在酶标仪测苦、性微寒。现代药理学研究发现，消癌平联合化疗可定490

4、nm处的吸光度OD。抑制率计算公式：(1一OD以提高晚期NSCLC患者的疗效，并且能有效抑制人肺实验组／OD对照组)×100。拟合消癌平剂量浓度一腺癌细胞的增殖并活化Caspase一3诱导细胞凋亡l4]。抑制率曲线，分别计算Ic。和IC。值，并认为Ic。是消但在逆转TKI非小细胞肺癌耐药方面尚无报道。本研癌平非细胞毒剂量，作为消癌平后续实验工作浓度究观察消癌平对厄洛替尼耐药NSCLC细胞株PC9／上限。G2耐药性的影响，并进一步明确消癌平逆转PC9／G21．4消癌平逆转厄洛替尼PC9／G2耐药考察：将对数耐药

5、的作用机制。生长期PC9／G2细胞用含10小牛血清的RPMI-16401材料和方法培养液调整细胞数为2×10／ml。取2块96孔板，先1．1主要试剂与材料：消癌平注射液(20ml／支)购自加入无毒性剂量消癌平30min后，由低到高浓度加入南京圣和药业有限公司；厄洛替尼购自武汉远成共创厄洛替尼0．O01、0．01、0．1、1、10、100~mol／L，每个浓科技有限公司，以DMSO助溶为1mmol／L浓度保存度设3个平行复孑L；同时设只加入厄洛替尼(浓度梯度待用；PI3K抑制剂Wortmannin购自上海叶舟生

6、物科同上)的阳性对照组；以及加入生理盐水的阴性对照技有限公司，以DMSO助溶为10nM浓度保存待用。组。‘每组均进行药物孵育，其余方法均与1．3相同，用四氮甲唑蓝(MTT)为SERVA公司产品；RNA提取试酶标仪检测OD值(490nm吸收值)。细胞存活率计算剂盒为Omega公司产品；cDNA合成试剂盒为公式：OD实验组／OD对照组×100Promega公司产品；PrimeScriptRT—PCRKit为大连1．5RT—PCR法测定PI3KmRNA表达：PC9／G2细宝生物公司产品；RPMI一1640培养基为G

7、IBCOBRL公胞分别经不同浓度消癌平(PBS、1、5、10mg／m1)或司产品；新生牛血清为杭州四季青产品。高速低温离PI3K抑制剂Wortmannin(5nM)和PBS处理24h后收心机为Beckman公司产品。水套式CO培养箱为长集细胞，Trizol法提取总RNA，反转录合成cDNA，以沙长棉应用技术研究所产品。酶标仪为BIORAD公cDNA为模板，进行PI3K基因和内参基因GAPDH扩司生产。增。反转录反应条件为42℃20min，95℃2min；PCR1．2细胞来源和培养：厄洛替尼耐药NSCLC细胞系

8、反应条件为94℃1min，55℃2min，72℃2min，3O次Pc9／G2购自同济大学附属上海市肺科医院肿瘤科L6]，循环。内参基因GAPDH引物序列为：上游5，-一浙江中医杂志2014年7月第49卷第7期GAGTCAACGGATTTGGTCGT一3’，下游5’一TT—3．8)VS(53±2．1)、(10±0．2％)V8(12±0．1)。GATTTTGGAGGGATCTCG-3’。目标基因PI3K