不同保存方式下金龟甲虫dna提取方法及28s rdna序列分析

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1、第25卷第6期沈阳大学学报(自然科学版)Vo1．25，No．62013年12月JournalofShenyangUniversity(NaturalScience)Dec．2013文章编号：2095—5456(2013)06—0436—05不同保存方式下金龟甲虫DNA提取方法及28SrDNA序列分析贾晨曦，郭晓华，刘广纯(沈阳大学a．生命科学与工程学院，b．辽宁省城市有害生物治理与生态安全重点实验室，辽宁沈阳110044)摘要：通过电泳检测和PCR扩增28Sr亡INA核基因序列的结果，比较了无水乙醇、75乙醇、针插干制3种金龟甲虫标

2、本的保存方式和SDS一蛋白酶K法、CTAB法、饱和NaC1法3种提取DNA方法．结果显示，SDS一蛋白酶K法、CTAB法提取3种保存方式的标本时，可成功提取DNA并有效扩增目的基因；饱和NaC1法仅能提取无水乙醇保存标本的DNA并扩增目的基因，而75乙醇保存标本和干制标本的DNA提取和基因扩增均不理想．关键词：金龟子；标本；保存方法；DNA提取；28SrDNA中图分类号：Q969．516．1文献标志码：A核酸序列携带生物起源、进化、种群多样性等捕捉法采集．重要信息[1]．核酸序列研究的重要前提是提取基1．2方法因组DNA．金龟子是鞘

3、翅目中较大的类群之一，1．2．1标本保存具有重要的经济和生态价值．植食性种类多是农(1)乙醇浸制标本．将采集的金龟子预先饥作物、林木、果树的重要害虫；粪食性或腐食性种饿24h以上，使其消化道内物质消化完全(防止类有清除粪便等保护环境作用．由于标本采集受外源DNA对目的DNA的干扰)，分别浸入无水季节、地域等因素限制，用活体或新鲜标本作为试乙醇及75乙醇中，12h置换1次乙醇，更换3材较为困难，标本保存方式十分重要[2]。DNA成次后于4℃冰箱保存，制成浸制标本．功提取也受提取方法的直接影响[33。∞．有关昆虫(2)干制标本．将样本饥

4、饿24h后，用昆虫针标本保存和基因组DNA提取方法的研究曾有过插于标本盒中，置于通风处自然阴干制成干制报道[4]，但金龟子相关研究报道十分有限．探讨金标本．龟子标本的最佳保存方式和DNA提取方法，对1．2．2基因组DNA提取于研究金龟类昆虫的分子系统发育关系，尤其对采用SDS蛋白酶K法、CTAB法、饱和NaC1昆虫分类新型技术——DNA条形码的研究具有法3种方法提取DNA．用无菌水清洗金龟子标本重要意s-．胸部3～5次，并用滤纸吸干．(1)SDS蛋白酶K法．①取虫体胸部肌肉1材料与方法0．1N0．2g，放人2．0mlEP管中，加入5

5、00L匀1．1材料浆液(0．1mol／LEDTA，pH一8．0；0．1mol／L以金龟科Scarabaeidae星花金龟属PotosiaNaC1；0．05mol／LTris—HC1，pH一7．6；109／6的白星花金龟Potosia(L．)brevitarsis(Lewis)作SDS；2mg／mL蛋白酶K)和少许灭菌的细石英为实验材料．砂，用玻璃棒研磨充分．②将研磨好的混合液置于样本于2010-2012年采自吉林、辽宁等地，55℃金属浴中消化12h左右．③加入500L收稿日期：2013—07—26基金项目：辽宁省自然科学基金资助项目

6、(201102157)；辽宁省科技厅科技计划项目(20082140O1)．作者简介：贾晨曦(1988一)，女，吉林长春人，沈阳大学硕士研究生；郭晓华(1961一)，女，辽宁台安人，沈阳大学教授；刘广纯(1959一)，男，辽宁绥中人，沈阳大学教授，博士生导师．第6期贾晨曦等：不同保存方式下金龟甲虫DNA提取方法及28SrDNA序列分析439(；enBar~T1e∞^锄CcGGccc敏e吼0殴GTCT1双1c端筑钮ncGG{掇cce啦eGTCG啦矾GGCC．CTT1蕊cC-C(；Ⅱ研I-，-．‘．--_-．--．-．．．．。t．．-_‘

7、．-．．_．．。_。-_．．‘．_．--‘．--‘，-．．．，-。--．★。-_．-．．．。。---，-_‘-．-．__．，。．．--。．-b．．。．．．．．．．．．．．．．．。．．．．。．．．．．．．，。．．．．．．．．。．．．．．．．．，。．．．．。．。．．．。．。．．．．。．．．．．．．．．．，．．．．．．．．．。．．，．．C，．．_‘，，t．．-‘．．。．．．．-，t__．--．．．--，．--．·，．，．_-‘。．-__．．‘．。．--．．，．，．-．．．，，。___。。．．．--．．，---，．t．_‘．-d．．．．．．

8、．．．．．．．．．．．．．。．．．．．．．．，．．．．．．。．．．。．．．．．．，。．．．．．．．．．．．．．．．．．。．．．．．．．．．．．．。+．．．．．．．，．．．．e．_．．_．-．．-，．‘．‘．．‘-，．．_．．---．-