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1、香菇液体培养过程中3种胞外酶酶活的变化摘要：研究了香菇［Lentinusedodes(Berk.)sing］808在液体培养时淀粉酶、竣甲基纤维素酶(CMC酶)、漆酶3种胞外酶酶活的变化，以及胞外蛋白质含量的变化。结果表明，淀粉酶酶活在培养第4天时出现高峰，CMC酶、漆酶酶活都在第13天达到最高值，说明香菇最先利用的物质是淀粉。胞外蛋白质含量的变化与总酚酚活变化基本相同。关键词：香菇［Lentinusedodes(Berk.)sing］；淀粉酶;竣甲基纤维素酶；漆酶中图分类号：S646.1+2文献标识码：A文章编号：0439-8114(2013)14-3391-03香菇［Lentin
2、usedodes(Berk.)Sing.］隶属于伞菌目，营养丰富，具有一定的药用价值［1］,且适应性强、栽培面积广。香菇生物降解木质纤维素及其他有机大分子是通过基质中的菌丝不断向胞外分泌各种酶来实现的，因此酶活的大小直接影响生物降解能力［2］,与香菇的产量密切相关。近年来有关香菇的品种选育、栽培及液体培养已有报道，但是尚未有香菇在液体培养条件下3种胞外酶酶活的研究报道。本研究重点探讨香菇液体培养时胞外酶的酶活，为营养生理研究以及香菇的高产栽培提供一定的理论依据。1材料与方法1.1材料1.1.1供测菌种808品种为浙江省主栽香菇品种。1.1.2培养基PDA培养基：马铃薯200g、葡萄糖
3、20g＞琼脂20g,用去离子水补足至1000mL,pH自然，于121°C灭菌20inin。液体培养基：马铃薯200g、葡萄糖20g.蛋白月东2g、MgS041g、KH2P041g、维生素BO.02g,pH自然，用去离子水定容至100mL（用250niL锥形瓶）,于121°C灭菌20min01.2方法1.2.1菌种的活化菌种活化以PDA培养基为基础培养基，在无菌条件下，用接种针从香菇菌种上切取1cm2的菌块至活化培养基上[3],于25°C培养箱中黑暗培养7〜12d,直至菌丝长满斜面，确定无污染且长势良好后作为供试菌种。1.2.2种子液的制备向液体培养基中接入供试菌种，每支斜面试管接一瓶
4、[4],3次重复，封口标记后置于（25±1）°C恒温摇床屮，以100r/min振荡培养8〜12d,即得种子液。1.2.3液体培养将种子液的菌丝球匀浆后接入培养基中，按接种量10%接种至液体培养慕中[5],置于（25±1）°C恒温摇床中以100r/min振荡培养。1.2.4粗酶液的制备定时观察，从第4天开始，每隔3d吸取发酵液5mL,于4°C下以4000r/min离心10min,上清液即为粗酶液,连续测定6次，最后一次制备酚液与前一次相隔2do1.2.5淀粉酶酶活的测定取10g/L可溶性淀粉溶液（用pH4.6,0.1mol/L醋酸缓冲液配制）1.2mU粗酶液0.8mL,于40°C水浴中
5、保温30min,取出后立即加入2mLDNS试剂,于沸水中显色10min。冷却后加入去离子水定容，混匀，于520mn[6]处测吸光度，以在沸水浴中煮沸灭活15min的酶液为对照，设置3个平行，取平均值。1个酶活单位(1U)定义为1mL的发酵液在40°C下1min生成0.1mg还原糖的淀粉酶的量[7]oDNS试剂具体制备方法参照文献[5]。1.2.6竣甲基纤维索酶(CMC酶)酶活的测定取5g/LCMC-Na溶液(fflpH4.6,0.1mol/L柠檬酸盐缓冲液配制)[5,8,9]lmL、粗酶液1mL,于50°C水浴中准确保温30min,Z后的操作方法与1.2.5同。1.2.7漆酶酶活的测
6、定采用ABTS法，具体参考文献[10,11]。3mL酶活反应体系含1nmol/LABTS0.5mL、酶液0.5mL和HOAc-NaOAc(pH4.5)缓冲液2.0mLo在反应的前3min内在420nm处测定吸光度的变化(每15s记录一次)。以1nmol/LABTS0.5mL、HOAc-NaOAc(pH4.5)缓冲液2.5mL的混合液作为对照。1.2.8蛋白质含量的测定采用考马斯亮蓝染色测定法[12]o具体操作如下：取去离子水0.9mL.粗酚液0.1mL、考马斯亮蓝染色液5mL至试管中，混合均匀，于595nm处测吸光度，以去离子水1mL、考马斯亮蓝5mL的混合液作为对照，设置3个平行试
7、验，取平均值。作牛血清白蛋白标准曲线，得出蛋白质含量。2结果与分析2.1香菇液体培养过程中淀粉酚、CMC酶、漆酶酚活的变化由图1A可知，淀粉酶酶活在培养的第4天达到最高值28.33Uo随后,淀粉酶酶活逐渐降低，直到降至第10天的3.94U,在第13天，乂出现一个小高峰。这表明香菇液体培养时最先利用的是淀粉。分析原因可能是在生长初期，菌丝生长需要大量的营养物质，而培养基中含有的大量淀粉成为最直接的营养源，这时淀粉酶发挥主要作用，酶活高；接下来酶活逐渐降低可能
