酶活测定方法.doc

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1、二十、果蔬中多酚氧化酶活性的测定一、目的要求了解多酚氧化酶的作用,掌握果蔬组织中多酚氧化酶活性的测定方法。二、基本原理多酚氧化酶(Polyphenoloxidase,PPO)是一种以铜为辅基的酶,能催化多种简单酚类物质氧化形成醌类化合物,醌类化合物进一步聚合形成呈现褐色、棕色或黑色的聚合物。在后熟衰老过程或在采后的贮藏加工过程中,果蔬出现的组织褐变与组织中的多酚氧化酶活性密切相关。多酚氧化酶催化邻苯二酚氧化形成的产物在420nm处有最大光吸收峰。因此,可利用比色法测定多酚氧化酶的活性。三、材料、仪器及试剂(

2、一)材料梨、苹果、马铃薯等。(二)仪器及用具研钵、高速冷冻离心机、分光光度计、计时器、移液器、离心管、试管、容量瓶(100mL、1000mL)。(三)试剂1.100mmol/L、pH5.5醋酸缓冲液母液A(200mmol/L醋酸溶液):量取11.55mL冰醋酸,加蒸馏水稀释至1000mL。母液B(200mmol/L醋酸钠溶液):称取16.4g无水醋酸钠(或称取27.2g三水合乙酸钠),用蒸馏水溶解、定容至1000mL。取68mL母液A和432mL母液B混合后,调节pH至5.5,加蒸馏水稀释至1000mL。2

3、.提取缓冲液(含1mMPEG、4%PVPP和1%TritonX-100)称取340mgPEG6000(聚乙二醇6000)、4gPVPP(聚乙烯吡咯烷酮,Polyvinyl–polypyrrolidone),取1mLTritonX-100,用100mmol/L、pH5.5醋酸缓冲液溶解、稀释至100mL。3.50mmol/L邻苯二酚称取275mg邻苯二酚,用50mmol/L、pH5.5醋酸缓冲液溶解、稀释至50mL。四、实验步骤(一)酶液制备称取5.0g果蔬组织样品,置于研钵中,加入5.0mL提取缓冲液,在冰

4、浴条件下研磨成匀浆,于4℃、12000×g离心30min,收集上清液即为酶提取液,低温保存备用。(二)活性测定取一支试管,加入4.0mL50mmol/L、pH5.5的醋酸缓冲液和1.0mL50mmol/L邻苯二酚溶液,最后加入100µL酶提取液,同时立即开始计时。将反应混合液倒入比色杯中,置于分光光度计样品室中。以蒸馏水为参比,在反应15s时开始记录反应体系在波长420nm处吸光度值作为初始值,然后每隔1min记录一次,连续测定,至少获取6个点的数据。重复三次。五、实验结果与计算1.将测定的数据填入下表重复

5、次数样品重量W(g)提取液体积V(mL)吸取样品液体积Vs(mL)420nm吸光度值样品中PPO活性(△OD420·min-1·g-1FW)OD0OD1OD2OD3OD4OD5△OD计算值平均值±标准偏差1232.计算结果记录反应体系在420nm处的吸光度值,制作OD420值随时间变化曲线,根据曲线的初始线性部分计算每分钟吸光度变化值△OD420。然后以每克鲜重(FW)果蔬样品每分钟吸光度变化值增加1时为1个PPO活性单位(U),则U=△OD420·min-1·g-1FW。计算公式:式中:△OD420——反

6、应混合液的吸光度变化值;△t——酶促反应时间,min;V——样品提取液总体积,mL;Vs——测定时所取样品提取液体积,mL;W——样品重量,g。PPO活性还可以每分钟反应体系在波长420nm处吸光度值变化增加1时所需的酶量为1个活性单位(U),表示为U=△OD420·min-1·mg-1蛋白质。酶提取液中蛋白质含量可利用考马斯亮蓝染色法进行测定。六、注意事项应进行预实验,测定每一分钟反应体系的吸光度值的变化,确定该酶促反应速度呈线性变化(初级反应)的时间段。这样,只测定某一段时间内反应溶液的初始吸光度值(O

7、D0)和最终值(ODt)这两个数据,就可以计算每分钟吸光度值变化的增加量。七、思考题随着反应时间的延长,多酚氧化酶活性将呈现什么样的变化?(四)超氧化物岐化酶活性测定一、目的要求学习果蔬组织中过超氧化物歧化酶活性的测定原理和方法。二、基本原理超氧化物歧化酶(Superoxidedismutase,SOD)普遍存在于动、植物与微生物体内。SOD是含金属辅基的酶。高等植物有两种类型的SOD:Mn-SOD和Cu/Zn-SOD。SOD能够清除超氧自由基(O2-),它与CAT、POD等酶协同作用来防御活性氧或其他过氧

8、化物自由基对细胞膜系统的伤害,从而减少自由基对有机体的毒害。超氧阴离子自由基(O2-)是生物细胞某些生理生化反应常见的中间产物。SOD能通过歧化反应清除生物细胞中的超氧阴离子自由基,生成H2O2和O2。H2O2再由CAT进一步催化生成H2O和O2。超氧化物岐化酶催化以下反应:由于超氧自由基非常不稳定,寿命极短,一般利用间接方法测定SOD活性。本实验依据SOD抑制氮蓝四唑(NBT)在光下的还原作用来确定酶活性的大小

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