酶活测定方法.doc

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1、二十、果蔬中多酚氧化酶活性的测定一、目的要求了解多酚氧化酶的作用，掌握果蔬组织中多酚氧化酶活性的测定方法。二、基本原理多酚氧化酶（Polyphenoloxidase，PPO）是一种以铜为辅基的酶，能催化多种简单酚类物质氧化形成醌类化合物，醌类化合物进一步聚合形成呈现褐色、棕色或黑色的聚合物。在后熟衰老过程或在采后的贮藏加工过程中，果蔬出现的组织褐变与组织中的多酚氧化酶活性密切相关。多酚氧化酶催化邻苯二酚氧化形成的产物在420nm处有最大光吸收峰。因此，可利用比色法测定多酚氧化酶的活性。三、材料、仪器及试剂（

2、一）材料梨、苹果、马铃薯等。（二）仪器及用具研钵、高速冷冻离心机、分光光度计、计时器、移液器、离心管、试管、容量瓶（100mL、1000mL）。（三）试剂1．100mmol/L、pH5.5醋酸缓冲液母液A（200mmol/L醋酸溶液）：量取11.55mL冰醋酸，加蒸馏水稀释至1000mL。母液B（200mmol/L醋酸钠溶液）：称取16.4g无水醋酸钠（或称取27.2g三水合乙酸钠），用蒸馏水溶解、定容至1000mL。取68mL母液A和432mL母液B混合后，调节pH至5.5，加蒸馏水稀释至1000mL。2

3、．提取缓冲液（含1mMPEG、4%PVPP和1%TritonX-100）称取340mgPEG6000（聚乙二醇6000）、4gPVPP（聚乙烯吡咯烷酮，Polyvinyl–polypyrrolidone），取1mLTritonX-100，用100mmol/L、pH5.5醋酸缓冲液溶解、稀释至100mL。3．50mmol/L邻苯二酚称取275mg邻苯二酚，用50mmol/L、pH5.5醋酸缓冲液溶解、稀释至50mL。四、实验步骤（一）酶液制备称取5.0g果蔬组织样品，置于研钵中，加入5.0mL提取缓冲液，在冰

4、浴条件下研磨成匀浆，于4℃、12000×g离心30min，收集上清液即为酶提取液，低温保存备用。（二）活性测定取一支试管，加入4.0mL50mmol/L、pH5.5的醋酸缓冲液和1.0mL50mmol/L邻苯二酚溶液，最后加入100µL酶提取液，同时立即开始计时。将反应混合液倒入比色杯中，置于分光光度计样品室中。以蒸馏水为参比，在反应15s时开始记录反应体系在波长420nm处吸光度值作为初始值，然后每隔1min记录一次，连续测定，至少获取6个点的数据。重复三次。五、实验结果与计算1．将测定的数据填入下表重复

5、次数样品重量W(g)提取液体积V(mL)吸取样品液体积Vs(mL)420nm吸光度值样品中PPO活性(△OD420·min-1·g-1FW)OD0OD1OD2OD3OD4OD5△OD计算值平均值±标准偏差1232．计算结果记录反应体系在420nm处的吸光度值，制作OD420值随时间变化曲线，根据曲线的初始线性部分计算每分钟吸光度变化值△OD420。然后以每克鲜重（FW）果蔬样品每分钟吸光度变化值增加1时为1个PPO活性单位（U），则U=△OD420·min-1·g-1FW。计算公式：式中：△OD420——反

6、应混合液的吸光度变化值；△t——酶促反应时间，min；V——样品提取液总体积，mL；Vs——测定时所取样品提取液体积，mL；W——样品重量，g。PPO活性还可以每分钟反应体系在波长420nm处吸光度值变化增加1时所需的酶量为1个活性单位（U），表示为U=△OD420·min-1·mg-1蛋白质。酶提取液中蛋白质含量可利用考马斯亮蓝染色法进行测定。六、注意事项应进行预实验，测定每一分钟反应体系的吸光度值的变化，确定该酶促反应速度呈线性变化（初级反应）的时间段。这样，只测定某一段时间内反应溶液的初始吸光度值（O

7、D0）和最终值（ODt）这两个数据，就可以计算每分钟吸光度值变化的增加量。七、思考题随着反应时间的延长，多酚氧化酶活性将呈现什么样的变化？（四）超氧化物岐化酶活性测定一、目的要求学习果蔬组织中过超氧化物歧化酶活性的测定原理和方法。二、基本原理超氧化物歧化酶（Superoxidedismutase，SOD）普遍存在于动、植物与微生物体内。SOD是含金属辅基的酶。高等植物有两种类型的SOD：Mn-SOD和Cu/Zn-SOD。SOD能够清除超氧自由基（O2-），它与CAT、POD等酶协同作用来防御活性氧或其他过氧

8、化物自由基对细胞膜系统的伤害，从而减少自由基对有机体的毒害。超氧阴离子自由基（O2-）是生物细胞某些生理生化反应常见的中间产物。SOD能通过歧化反应清除生物细胞中的超氧阴离子自由基，生成H2O2和O2。H2O2再由CAT进一步催化生成H2O和O2。超氧化物岐化酶催化以下反应：由于超氧自由基非常不稳定，寿命极短，一般利用间接方法测定SOD活性。本实验依据SOD抑制氮蓝四唑（NBT）在光下的还原作用来确定酶活性的大小