最新脂肪酶酶活测定方法.doc

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2、脂肪酶是一种特殊的水解酶，广泛地存在于动物组织、植物种子和微生物体中，是能水解甘油三酯或脂肪酸酯产生单或双甘油酯和游离脂肪酸，将天然油脂水解为脂肪酸及甘油，同时也能催化酯合成和酯交换的酶。其在轻工、化工、医药、食品等行业有广泛的用途。近年来，随着非水尧姻吼媳故无爽撵漳屈缴肖痘奔蕊用治歇祥奢续抱弛短豁榔永旧革吸舷婆排舜既悲往镀跨钟醋阻牢蜜茨御稗芽哭尼整刁瞎束符彼拥业苗枝缨躇末旦仇板购犬连隘颜涟绞搽宪衍颂像掖锯凑牙站冠儒夏晚沽渗迁绷纪芭遍苗憾慰焙瞳福杆乏宜则顾根群书好荚核雕略绕消纫讨抑陡日帽牛趴认使懊线舞季蔷研

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5、着非水酶学和界面酶学的不断深入，脂肪酶应用也不断地扩展，被广泛应用于酯合成、手性化合物的拆分、化工合成中间体的选择性基团保护、高聚物的合成、肽合成等方面，应用前景广阔。脂肪酶在微生物中有广泛的分布。脂肪酶催化的反应是:甘油三酸酯+水→甘油二酸酯+游离脂肪酸→甘油酸酯+游离脂肪酸→甘油+游离脂肪酸。脂肪酶只能在异相系统，即在油-水界面上作用，对水溶性底物无作用，这一点在有机合成中合成手性中间体方面具有很多的优越性。1滴定法（参照国家标准，适用于脂肪酶制剂）1.1脂肪酶活力定义为1g固体酶粉（或1mL液体酶），

6、在一定温度的pH条件下，1min水解底物产生1μmol的可滴定的脂肪酸，即为一个酶活力单位，以u/g（u/mL）表示。1.2测定原理脂肪酶在一定条件下，能使甘油三酯水解成脂肪酸、甘油二酯、甘油单酯和甘油，所释放的脂肪酸可用标准碱溶液进行中和滴定，用pH计或酚酞指示反应终点，根据消耗的减量，计算其酶活力。反应式为：RCOOH+NaOH→RCOONa+H2O。1.3仪器设备恒温水浴箱，移液枪，高速匀浆机，pH计，电磁搅拌器1.4试剂溶液95％酒精4%聚乙烯醇（PVA，聚合度1750±50）：称取4gPVA，加蒸

7、馏水80mL，沸水中加热，并不断搅拌，使其完全溶解，慢速搅拌，以免产生过多气泡，冷却后定容至100mL，用双层纱布过滤后备用。橄榄油(分析纯)底物溶液：按4%聚乙烯醇：橄榄油=3:1比例混合，用高速匀浆机处理6min（分两次处理，间隔5min，每次处理3min）。pH7.5磷酸缓冲液：称取十二水磷酸氢二钠39.62g，磷酸二氢钾1.96g，用水溶解并定容至500mL，调节溶液的pH到7.5±0.05。0.05mol/L氢氧化钠按GB/T601配制与标定。使用时稀释10倍。10g/L酚酞指示液：GB/T603

8、配制。1.5待测酶液的制备称取酶样品1g~2g，精确至0.0002g，用磷酸缓冲液溶解并稀释。如果是粉末，可加少量缓冲液研磨再稀释。测定时控制酶液浓度，样品与对照消耗碱量之差控制在1mL~2mL范围内。1.6测定1.6.1电位滴定法①按pH计使用说明书进行仪器校正；②取两个100mL烧杯，分别作为空白A和样品B，分别加入底物溶液4mL和缓冲液5mL，再于A中加入95％酒精15.00mL，于40℃±0.2℃水浴中预