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1、、酶活测定方法还原法酶与底物在特定的条件下反应,酶可以促使底物释放出还原性的基团。在此反应体系中添加化学试剂,酶促反应的产物可与该化学试剂发生反应,生成有色物质。通过在特定的波长下比色,即可求出还原产物的含量,从而计算出酶活力的大小。色原底物法通过底物与特定的可溶性生色基团物质结合,合成人工底物。该底物与酶发生反应后,生色基团可被释放出来,用分光光度法即可测定颜色的深浅,在与已知标准酶所做的曲线比较后,即可求出待测酶的活力。粘度法该法常用于测定纤维素酶、木聚糖酶和β-葡聚糖酶的活力。木聚糖和β-葡聚糖溶液通常情况下可形成极高的粘度,当酶作用于粘性底物时木聚糖和β-葡聚糖会被切
2、割成较小的分子使其粘度大为降低。基于Poiseuille定律我们知道,只要测定一定条件下溶剂和样品溶液的运动粘度,便可计算特性粘数,并以此来判断酶的活力。高压液相色谱法酶与其底物在特定的条件下充分反应后,在一定的色谱条件下从反应体系中提取溶液进行色谱分析,认真记录保留时间和色谱图,测量各个样的峰高和半峰高,计算出酶促反应生成物的含量,从而换算出酶活力的数值。免疫学方法常用于酶活性分析的免疫学方法包括:免疫电泳法、免疫凝胶扩散法。这两种方法都是根据酶与其抗体之间可发生特定的沉淀反应,通过待测酶和标准酶的比较,最终确定酶活力。免疫学方法检侧度非常灵敏,可检侧出经过极度稀释后样品中
3、的酶蛋白,但其缺点是不同厂家生产的酶产品需要有不同特定的抗体发生反应。琼脂凝胶扩散法将酶作用的底物与琼脂混合熔融后,倒入培养皿中或载波片上制成琼脂平板。用打孔器在琼脂平面上打出一个约4-5mm半径的小孔。在点加酶样并培养24h以后,用染色剂显色或用展开剂展开显出水解区,利用水解直径和酶活力关系测定酶活力。蛋白酶活力测定法本方法适用于酿造酱油时在制品菌种、成曲的蛋白酶活力测定。1福林法1.1试剂及溶液:以下试剂都为分析纯1.1.1福林试剂(Folin试剂):于2000mL磨口回流装置内,加入钨酸钠(Na2WO4·2H2O)100g,钼酸钠(Na2MoO4·2H2O)25g,蒸馏
4、水700mL,85%磷酸50mL,浓盐酸100mL,文火回流10h。取去冷凝器,加入硫酸锂(Li2SO4)50g,蒸馏水50mL,混匀,加入几滴液体溴,再煮沸15min,以驱逐残溴及除去颜色,溶液应呈黄色而非绿色。若溶液仍有绿色,需要再加几滴溴液,再煮沸除去之。冷却后,定容至1000mL,用细菌漏斗(No4～5)过滤,置于棕色瓶中保存。此溶液使用时加2倍蒸馏水稀释。即成已稀释的福林试剂。1.1.20.4mol碳酸钠溶液:称取无水碳酸钠(Na2CO3)42.4g,定容至1000mL。1.1.30.4mol三氯乙酸(TCA)溶液:称取三氯乙酸(CCL3COOH)65.4g,定容至
5、1000mL。1.1.4pH7.2磷酸盐缓冲液:称取磷酸二氢钠(NaH2PO4·2H2O)31.2g,定容至1000mL,即成0.2mol溶液(A液)。称取磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O)71.63g,定容至1000mL,即成0.2mol溶液(B液)。取A液28mL和B液72mL,再用蒸馏水稀释1倍,即成0.1molpH7.2的磷酸盐缓冲液。1.1.52%酪蛋白溶液:准确称取干酪素2g,称准至0.002g,加入0.1N氢氧化钠10mL,在水浴中加热使溶解(必要时用小火加热煮沸),然后用pH7.2磷酸盐缓冲液定容至100mL即成。配制后应及时使用或放入冰箱内保存,否则极
6、易繁殖细菌,引起变质。1.1.6100μg/mL酪氨酸溶液:精确称取在105℃烘箱中烘至恒重的酪氨酸0.1000g,逐步加入6mL1N盐酸使溶解,用0.2N盐酸定容至100mL,其浓度为1000μg/mL,再吸取此液10mL,以0.2N盐酸定容至100mL,即配成100μg/mL的酪氨酸溶液。此溶液配成后也应及时使用或放入冰箱内保存,以免繁殖细菌而变质。1.2仪器a.分析天平:感量0.1mg;b.581-G型光电比色计或72型分光光度计;c.水浴锅;d.1、2、5、10mL移液管等。1.3操作1.3.1标准曲线的绘制1.3.1.1按下表配制各种不同浓度的酪氨酸溶液(表1)。表
7、1配制各种不同浓度的酪氨酸溶液━━━━━━━━━━━┳━━━━━━━━━━━━━━━━━━┃管号试剂┣━━┳━━┳━━┳━━┳━━┳━━━┃1┃2┃3┃4┃5┃6━━━━━━━━━━━╋━━╋━━╋━━╋━━╋━━╋━━━蒸馏水,mL┃10┃8┃6┃4┃2┃0100μg/mL酪氨酸,mL┃0┃2┃4┃6┃8┃10酪氨酸最终浓度,μg/ml┃0┃20┃40┃60┃80┃100━━━━━━━━━━━┻━━┻━━┻━━┻━━┻━━┻━━━1.3.1.2测定步骤:取6支试管编号按表1分别吸取不同浓度酪氨酸1mL
