木糖异构酶酶活测定方法

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1、木糖异构酶酶活测定方法：采用XI-SDH(木糖异构酶偶联山梨醇脱氢酶)一步法（KuyperMetal.2003）：100mM，pH7.5Tris-HCl，500mMxylose，10mMMgCl2，粗酶液10μl，1USDH，0.15mMNADH，在340nm下检测NADH被氧化的量（即在340nm下做时间扫描）。酶的比活力定义为每mg酶蛋白，每分钟转化NADPH的μmolL-1数，即Umg-1蛋白。酶活力测定还可以采用XI-SDH两步法（LönnAetal.2002）：第一步：500mmol/LD-木糖，粗酶液10μl，10mmol/LMgCl2，100mmol/LTris-HClpH7.5

2、缓冲液，作为底物溶液。将底物溶液在30℃下保温，加入粗酶液10μl，在30℃下反应10min，加入150µL50%三氯乙酸终止反应和185µL2MNa2CO3中和反应缓冲液。第二步：取0.1mL反应液加入100mM，pH7.5Tris-HCl，1USDH(sigma)和0.15mMNADH，立即混匀，30℃下在340nm下检测NADH被氧化的量（即在340nm做时间扫描）。酶的比活力定义为每mg酶蛋白，每分钟转化NADPH的μmolL-1数，即Umg-1蛋白。2.9.4木糖异构酶最适反应温度的测定采用XI-SDH两步法（LönnAetal.2002）：第一步：500mmol/LD-木糖，10m

3、mol/LMgCl2，100mmol/LTris-HClpH7.5缓冲液，作为底物溶液。将底物溶液在不同温度（20℃-80℃）下保温，加入粗酶液10μl，在不同温度下反应10min，加入150µL50%三氯乙酸终止反应和185µL2MNa2CO3中和反应缓冲液。第二步：取0.1mL反应液加入100mM，pH7.5Tris-HCl，1USDH(sigma)和0.15mMNADH，立即混匀，30℃下在340nm下检测NADH被氧化的量（即在340nm做时间扫描）。以比酶活为纵坐标，温度为横坐标作图，求出酶最适反应温度。2.9.5木糖异构酶最适pH值的测定采用XI-SDH两步法（LönnAetal.

4、2002）：第一步：配置终浓度为100mmol/L缓冲液：sodiumacetate、tris，在室温下调pH5-10。500mmol/LD-木糖，10mmol/LMgCl2，100mmol/L不同pH缓冲液，作为底物溶液。将底物溶液在30℃下保温，加入粗酶液10μl，在30℃下反应10min，加入150µL50%三氯乙酸终止反应和185µL2MNa2CO3中和反应缓冲液。第二步：取0.1mL反应液加入100mM，pH7.5Tris-HCl，1USDH(sigma)和0.15mMNADH，立即混匀，30℃下在340nm下检测NADH被氧化的量（即在340nm做时间扫描）。以比酶活为纵坐标，pH

5、值为横坐标作图，求出酶最适反应pH。