香港海鸥形菌检验与实验程序.ppt

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1、香港海鸥形菌(Laribacterhongkongersis)检验技术与实验程序采样材料剪刀、酒精棉球、酒精灯；无菌棉签、试管、试管架；表格、签字笔、记号笔；白大衣、乳胶手套、围裙；污物袋、毛巾、肥皂等实验材料（1）制备SS、XLD、CCDA、TCBS、MacConkey琼脂（MA）以及改良头孢哌酮MacConkey琼脂（CMA）等六种培养基，但我们对CMA中的头孢哌酮（Cefoperazone）浓度略做调整，其含量为16mg/L或24mg/L。Cary-Blair运送培养基（72h）实验材料（1）SS、XLD、TCBS、MA及CMA培养

2、皿置37℃，48h；CCDA培养皿置5%CO2环境培养，42℃，48h。注意事项：新鲜配制保持湿度头孢哌酮各类标本采样人体标本，肠道门诊患者采样,C-B运送鱼类标本，现场解剖，采用无菌棉签采集鱼体中、后肠内粪便，插入C-B运送培养基带回实验室，划线接种于MA、CMA两种培养皿。鸟类标本，栖息地灌木丛、树叶上新鲜粪便；幼鸟肛拭采样;C-B运送生理生化试验革兰染色MA、CMA培养基上分离到的无色、透明、扁平状，直径在0.5mm～1.0mm之间的微小菌落，进行氧化酶、触酶、三糖铁反应试验。氧化酶、触酶试验同时阳性，且三糖反应阴性的可疑细菌接种于

3、API20NE、ID32E生化条，做进一步的生化试验基因诊断特异性PCR的引物设计，根据我们首次分离到的香港海鸥形菌杭州株（杭州株：LHHZ242；Genbank登录号：DQ396525）的16SrRNA序列设计引物：P2F：5’TTGAGGGTGCCCGAAAGGGA3’P2B：5’CTACCCACTTCTGGCGGATT3’基因诊断步骤PCR模板DNA的制备,用接种环挑取经生化试验检测为可疑菌落若干，于500μl无菌蒸馏水中，振荡混匀，7000/rpm离心5min，去上清；加入500μl无菌蒸馏水，水浴煮沸10min，7000/rpm

4、离心5min，取上清液作为模板。以LH杭州株LHHZ242模板DNA为阳性模板对照，并以蒸馏水为阴性模板对照。基因诊断步骤反应体系（50μl）：10×PCR缓冲液5μl，25mmol/LMgCl24μl，2.5mmol/LdNTPs4μl，5U/μl的TaqDNA聚合酶0.25μl，0.6mmol/L的引物各1μl，模板DNA5μl，双蒸水29.75μl。基因诊断步骤反应程序：94℃5min；94℃0.5min，55℃0.5min，72℃1min，35个循环；72℃5min。16SrRNA基因测序16SrRNA基因测序：从特异引物PCR阳

5、性菌株中，随机抽样，进行16SrRNA基因PCR扩增,方法参照文献。PCR扩增产物由上海Sangon公司进行序列测定。16SrRNA引物：PLW264：5’-GAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’LPW265：5’-GNTACCTTGTTACGACTT-3’形态学检查透射电镜（TEM）观察，取LH人体株LHHZ242与草鱼株LHHZ27，经无菌蒸馏水洗脱，2%PTA染色2min～5min，在TEM下观察其菌体大小及形态特征。实验程序无菌采样,C-B运送CMA、MA上典型菌落革兰染色（阴性）氧化酶、触酶（同时阳性）三糖铁（阴性）PCR

6、16SrRNA结果讨论经48h培养后，菌落在CMA培养基上呈无色、透明、扁平状，边缘光滑整齐，直径在0.5mm～1.0mm之间的微小菌落；在MA上可见少量的上述可疑菌落混杂在众多的粉红色菌落之中。菌落挑取时与琼脂面无粘连。结果讨论从人体、鱼类分离到的LH菌株，氧化酶、触酶试验为阳性与三糖铁试验阴性。采用ID32E、API20NE试剂条进行检测，其生理生化试验结果除CAP（Yuan等报道为阳性，本文结果为阴性。）外，均与香港株HKU1相符合结果讨论氧化酶、触酶与三糖铁3项生化试验均符合筛选标准的标本，共计21株，其中人体株4株，鱼类株17株

7、，经特异引物PCR检测，结果均阳性。结果讨论从中选择8株（人体2株，鱼类6株）进行16SrRNA基因序列分析，经BLAST比对显示，与Yuen等报道[1]LH香港株HKU1（登录号：AF389085）相应序列的相似度达99%～100%（人体株GenBank登录号：EF032599、EF032594；鱼类株GenBank登录号：EF032595~EF032598、EF032600、EF032601）。结果讨论LHHZ242株与LHHZ27株在TEM下菌体均呈海鸥形弯曲，菌体长为2.5μm～3.5μm，菌体两端均可见鞭毛，鞭毛长约9.0μm，

8、约为菌体的3倍；单端鞭毛数量最多可达9根，其中LHHZ242株最多可见5根；而LHHZ27株则最多可达9根（见图2a、b）；来自不同生物体的菌株形态与大小无差异。结果讨论调查结果显示，杭州市社